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KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用.pdf

来源：花匠小妙招时间：2024-11-09 23:36

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010392309.5 (22)申请日 2020.05.11 (71)申请人青岛农业大学地址 266000 山东省青岛市城阳区长城路 700号 (72)发明人宋丽敏梁文星徐阳郭倩倩 (74)专利代理机构青岛合创知识产权代理事务所(普通合伙) 37264 代理人王晓晓 (51)Int.Cl. C12N 15/29(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/12(2018.01) A01H 6/82(2018.01) (54)发明名称。

2、一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用 (57)摘要本发明提供了一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到KLP1基因，构建了番茄KLP1基因敲除重组载体pTX-KLP1、基因敲除重组菌株LBA4404-pTX- KLP1及其番茄KLP1基因敲除纯合株系，本发明证实了敲除KLP1基因可以有效提高番茄抗灰霉菌侵染的能力，并且番茄KLP1基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的病斑直径及叶片中的灰霉量均明显减小。本发明通过实验证实KLP1基因在提高番茄抗灰霉病方面具有应用价值，并为利用 KLP1基因培育抗病植株奠定良好的。

3、理论和应用基础。权利要求书1页说明书5页序列表5页附图3页 CN 111549038 A 2020.08.18 CN 111549038 A 1.一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述KLP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：（1）构建KLP1基因敲除重组载体：根据KLP1基因的CDS序列设计引物并进行PCR扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶对其进行酶切，回收酶切产物后与质粒进行连接，得到 KLP1基因敲除重组。

4、载体；（2）构建KLP1基因敲除重组菌株：将所述KLP1基因敲除重组载体转化至农杆菌中，得到 KLP1基因敲除重组菌株；（3）构建KLP1基因敲除株系：将所述KLP1基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素进行筛选并培养至得到再生植物，即得到KLP1基因敲除株系。 3.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（1）中引物的序列为 KLP1-F0： 5 -ATATATGGTCTCGTTTGAAGGTGAAGATCTAAGAGCGTTTTAGAGC TAGAAATAGC-3 ； KLP1-R0： 5 -ATTATTGGT。

5、CTCGAAACGAACCCGTCACTCTTCTGAACAAACTACA CTGTTAGATTC-3 。 4.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述质粒为pTX-041。 5.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述基因敲除重组载体为pTX-KLP1。 6.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述农杆菌为LBA4404。 7.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述步骤（3）中培养的条件为16h光照/8h。

6、黑暗。 8.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述KLP1基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。 9.根据权利要求2所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，番茄KLP1基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的灰霉量明显降低。 10.根据权利要求1-9任一项所述的KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用，其特征在于，所述植物为番茄。权利要求书 1/1 页 2 CN 111549038 A 2 一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用技术领域 0001 本发明属于植物基因工程领域，。

7、具体涉及一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。背景技术 0002 番茄是我国重要的经济作物，由半知菌亚门葡萄孢属的灰葡萄孢真菌（又名灰霉菌）引起的番茄灰霉病是番茄生产中的重要病害之一，是威胁番茄生产的一种毁灭性的腐生型真菌性病害。灰葡萄孢不仅侵染番茄的果实，还会侵染番茄的茎、叶、花等不同的部位，且传播速度快，严重影响番茄的产量和经济效益。灰葡萄孢还有易变异和多型性的特点，容易受环境和寄主的影响而产生新的变异。目前对番茄灰霉病的防治主要是化学防治和农业防治，但防治效果均不理想，因此需要深入研究植物的的抗病机制及其与病原互作的分子机制，为。

8、通过基因工程手段控制番茄灰霉病的发生提供依据，从而为番茄灰霉病的防治提供新的思路。 0003 Bet-v-1结构域是以桦树主要致敏原Bet v I命名的，具有该结构域的蛋白多属于植物病程相关蛋白家族10 （PR-10），其在双子叶植物中广泛存在，大小约为15-17 kD。近几年，大量的含有Bet-v-1结构域的蛋白被鉴定，但是彼此之间的同源性都不高。其中， PR-10 为木本植物主要的花粉致敏原以及水果、蔬菜、种子中主要的致敏原，其表达水平受病原侵染、机械损伤及非生物胁迫影响而变化；贯叶连翘间萘二蒽酮金丝桃素合成相关酶Hyp-1基因也属于PR-10家族；。

9、细胞分裂素特异结合蛋白、罂粟的主要乳胶蛋白及成熟相关蛋白均含有Bet-v-1结构域。 0004 番茄KLP1蛋白为番茄特有的小分子蛋白，共812个核苷酸，编码147个氨基酸，该蛋白中具有保守的功能结构域Bet-v-1，但KLP1蛋白与PR-10家族之间存在很大的区别，比如 KLP1蛋白分子量比PR-10家族小，且不含有PR-10家族蛋白保守的P-loop等，但目前番茄 KLP1蛋白的生物学功能尚不明确。发明内容 0005 本发明提供了一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。本发明从番茄中分离和克隆到KLP1基因，构建了KLP1基因敲除重组载体pTX-KLP。

10、1及其纯合株系，并且证实了KLP1基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力。 0006 为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：本发明提供了一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用。 0007 进一步的，所述KLP1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 0008 进一步的，所述应用包括以下步骤：（1）构建KLP1基因敲除重组载体：根据KLP1基因的CDS序列设计引后，并以质粒pTX-043 为模板，进行PCR扩增；扩增产物纯化后，使用限制性内切酶BsaI对其进行酶切，回收酶切产物后与pTX-041质粒进行连接，得到KLP1基因敲除重。

11、组载体；说明书 1/5 页 3 CN 111549038 A 3 （2）构建KLP1基因敲除重组菌株：将所述KLP1基因敲除重组载体转化至农杆菌中，得到 KLP1基因敲除重组菌株；（3）构建KLP1基因敲除株系：将所述KLP1基因敲除重组菌株转化进植物子叶中，使用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，并培养至得到再生植物，即得到KLP1基因敲除株系。 0009 进一步的，所述步骤（1）中引物的序列为 KLP1-F0： 5 -ATATATGGTCTCGTTTGAAGGTGAAGATCTAAGAGCGTTTTAGAGC TAGAAATAGC-3 ； KLP1-R0： 5。

12、 -ATTATTGGTCTCGAAACGAACCCGTCACTCTTCTGAACAAACTACA CTGTTAGATTC-3 。 0010 进一步的，所述基因敲除重组载体为pTX-KLP1。 0011 进一步的，所述农杆菌为LBA4404。 0012 进一步的，所述步骤（3）中培养的条件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。 0013 进一步的，所述KLP1基因敲除株系与野生型株系相比，叶子上的病斑直径明显减小。 0014 进一步的，番茄KLP1基因敲除株系与野生型株系相比，叶片上的灰霉量明显降低。 0015 进一步的，所述植物为番茄。 0016 与现有技术相比。

13、，本发明的优点和技术效果：本发明从番茄中分离和克隆到KLP1基因，并进一步将KLP1基因靶点信息连接到基因敲除载体pTX-041上，获得KLP1基因敲除重组载体pTX-KLP1，再利用农杆菌得到基因敲除重组菌株LBA4404-pTX-KLP1，并侵染转化番茄子叶，得到纯合的KLP1基因敲除株系，通过研究基因敲除转基因株系的表型，并将其与相同条件下生长的野生型番茄的叶子上的病斑进行比较。本发明通过实验分析首次证明了KLP1基因具有调控番茄对灰霉病抗病性的功能，而敲除KLP1基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力；KLP1基因敲除纯合株系叶子上的病斑明显减小，。

14、灰霉量也明显低于野生型番茄株系。本发明的技术方案对KLP1基因在提高番茄对灰霉病的抗病性上具有应用价值，同时也为利用KLP1基因培育抗病、高产的番茄品种奠定良好的理论和应用基础。附图说明 0017 图1为灰葡萄孢侵染后24h内KLP1基因的相对表达量，（*p0.01）。 0018 图2为KLP1基因的PCR扩增及电泳检测结果，其中M为DNA marker， 1和2均为pTX- KLP1。 0019 图3为KLP1基因T2代纯合敲除突变体突变位点序列比较结果。 0020 图4A为KLP1基因敲除纯合株系的抗病性变化结果；图4B为KLP1基因敲除纯合株系中叶片上病斑直径的结果，（。

15、*p0.01）。 0021 图5为KLP1基因敲除纯合株系叶片中的灰霉量的结果，（*p0.01）。说明书 2/5 页 4 CN 111549038 A 4 具体实施方式 0022 以下结合附图和具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。 0023 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂、仪器等，如无特殊说明，均为市售商品。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。 0024 下述实施例中所述的PQB载体、 pTX-041载体和pTX-043载体为市售商品。 0025 实施例1：番茄KLP1基因的扩增。

16、及表达模式分析 1、在GeneBank数据库中获得番茄KLP1基因的CDS序列，其长度为441 bp，编码含有147 个氨基酸的蛋白质，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，根据番茄KLP1基因的CDS序列设计特异性引物，引物序列如下： PQB-KLP1-F： 5 -ATGGGTTTAAAAGGTAAGTTGATTG-3 （SEQ ID NO.3）； PQB-KLP1-R： 5 -AATCTTGTGGAGGTGACCCTCTA-3 （SEQ ID NO.4）。 0026 使用TRI Reagent提取番茄的总RNA，采用反。

17、转录试剂盒进行反转录后得到cDNA 链，之后以其作为模板，使用上述特异性引物对获得的cDNA进行高保真酶扩增，再将获得的扩增产物进行回收、纯化后克隆到PQB载体上，获得PQB-KLP1重组质粒，送至生物公司测序确认序列。 0027 2、将孢子浓度为106的灰霉菌孢子接种至野生型番茄上，分别在接种后0、 4、 8、 12、 24小时取样，并使用qRT-PCR检测番茄中KLP1基因的表达量，以番茄Actin基因作为内参。其中， qRT-PCR所用的引物是根据步骤1获得的测序结果而进行设计的，该引物对的序列为： KLP1-qPCR-F： 5 -GCTGGTTCAATAA。

18、TTGGCTGGA-3 （SEQ ID NO.5）； KLP1-qPCR-R： 5 - AAGAGTGACGGGTTCTGGTG -3 （SEQ ID NO.6）；内参引物的序列为： Sl-Actin-qRT-F： 5 -TTGCTGACCGTATGAGCAAG-3 （SEQ ID NO.7）； Sl-Actin-qRT-R： 5 -GGACAATGGATGGACCAGAC-3 （SEQ ID NO.8）。 0028 检测结果如图1所示，在24小时内，随着灰霉菌的侵染，KLP1基因的mRNA水平迅速下降，由此说明在灰霉菌侵染番茄的过程中KLP1基因可以起到重要作用。 0029。

19、实施例2：番茄KLP1基因敲除突变体和纯合株系的获得 1、番茄KLP1基因敲除突变体的获得（1）载体构建 KLP1全长基因编码序列（CDS）如SEQ ID NO.9所示，在CRISPRdirect网站输入KLP1基因全序列，根据结果筛选合适的靶点，其中选择的靶点分别为： GAAGGTGAAGATCTAAGAGC和 GAACCCGTCACTCTTCTGAA，并据此设计引物，引物序列如下： KLP1-F0： 5 -ATATATGGTCTCGTTTGAAGGTGAAGATCTAAGAGCGTTTTAGAGC TAGAAATAGC-3 （SEQ ID NO.10）； KLP。

20、1-R0： 5 -ATTATTGGTCTCGAAACGAACCCGTCACTCTTCTGAACAAACTACA CTGTTAGATTC-3 （SEQ ID NO.11）。说明书 3/5 页 5 CN 111549038 A 5 0030 以质粒pTX-043为模板， KLP1-F0和KLP1-R0为引物，并通过高保真酶对靶点序列 KLP0 （敲除靶点）进行PCR扩增，电泳结果如图2所示，将扩增产物进行回收、纯化；使用限制性内切酶Bsa I对纯化PCR产物和pTX-041质粒进行酶切，分别回收后，在T4连接酶的催化下进行过夜连接；连接完成后，将连接产物转化进大肠杆菌J。

21、M109，挑选含有重组质粒的阳性克隆送公司测序，最后将测序无误的重组质粒命名为pTX-KLP1。其中，质粒筛选时所用引物的序列如下： PTX-Fw： 5 - AGCGGATAACAATTTCACACAGGA -3 （SEQ ID NO.12）； PTX-Rv： 5 - GCAGGCATGCAAGCTTATTGG-3 （SEQ ID NO.13）。 0031 （2）转基因植株的制备将重组载体pTX-KLP1转化至农杆菌LBA4404中，得到重组菌株LBA4404-pTX-KLP1。 0032 按照农杆菌介导的转基因方法利用重组菌株LBA4404-pTX-KLP1对番茄子叶进。

22、行转化；再利用抗生素Kan对转化的愈伤组织进行筛选，同时设置转空载体作为对照；每2-3周更换培养基直到得到再生苗，其中培养条件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。 0033 分别提取再生苗的基因组DNA，对KLP1基因包含靶点的部分序列进行PCR扩增，所用引物的序列为： PQB-KLP1-F： 5 -ATGGGTTTAAAAGGTAAGTTGATTG-3 （SEQ ID NO.14） KLP1-R771： 5 -CGATATGGAGAGGATGATGTATATAC-3 （SEQ ID NO.15）。 0034 将得到的PCR产物经电泳检测后切胶送生物公司测序；。

23、如果序列靶点附近开始有套峰或者序列在两个靶点之间有部分缺失，则说明该植株为KLP1敲除阳性植株。测序结果显示，本发明得到2个KLP1敲除阳性植株，并分别标记为KLP1-1和KLP1-30。 0035 2、番茄KLP1基因敲除纯合株系的获得收获T0代敲除阳性植株KLP1-1和KLP1-30的种子作为T1代；分别将得到的T1代种子播种，待2-3周后每个敲除系分别取5-10棵植株，提取其基因组DNA，用PQB-KLP1-F和KLP1- R771引物对进行PCR扩增， PCR产物回收后连接pMD-18T载体，挑选阳性克隆送公司测序。每个敲除系的植株送4个样品去克隆。测。

24、序结果显示，每个敲除系植株的4个克隆样品均无套峰，且靶点位置发生突变或两个靶点之间发生部分缺失，由此确定样品均为KLP1基因敲除纯合株系。 0036 将鉴定得到的两株阳性KLP1基因敲除纯合株系分别命名为敲除系KLP1-1-3和 KLP1-30-5。与野生型植株相比，敲除系KLP1-1-3基因中缺失该基因的第153位，发生移码突变；敲除系KLP1-30-5基因中缺失该基因的第152-153位，发生移码突变；具体的比对序列信息见图3。将得到的KLP1基因敲除纯合株系移栽大盆，收取种子，用于后续的实验。 0037 实施例3：阳性番茄KLP1基因敲除植株表型的鉴定。

25、1、将KLP1基因敲除株系KLP1-1-3和KLP1-30-5与野生型番茄（WT）的种子分别播种于营养土中，培养于温室中，其中培养条件为16h光照（26） /8h黑暗（18）。然后，选取4周左右、大小长势相同的KLP1基因敲除纯合株系与野生型各3组，每组含3棵番茄植株，用孢子浓度为106的孢子液接种番茄叶片，将叶片置于塑料盒中，上面敷上一层保鲜膜以保持百分百湿度，在22下保持24-48小时后观察番茄叶片发病情况并进行数据统计。结果如图4A和4B 所示，与野生型相比，KLP1基因敲除纯合株系叶子上的病斑直径明显减小。 0038 2、对灰霉菌侵染后的番。

26、茄叶片提取总RNA，用qRT-PCR检测叶片中的灰霉量，并使说明书 4/5 页 6 CN 111549038 A 6 用番茄Actin做内参，所用引物序列如下： -Tubulin-F： 5 -ACCGTTCCAGAGTTGACTCAA-3 （SEQ ID NO.16） -Tubulin-R： 5 -GCAAGAAAGCCTTTCTTCTGA-3 （SEQ ID NO.17）结果如图5所示，KLP1基因敲除纯合株系中的灰霉量明显低于野生型番茄。 0039 以上证据表明KLP1基因对番茄抵抗灰霉菌侵染有重要作用，且敲除KLP1基因可以有效提高番茄抵抗灰霉菌侵染的能力，因此番茄KLP。

27、1基因具有调控番茄抵抗灰霉菌侵染的功能。 0040 以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。说明书 5/5 页 7 CN 111549038 A 7 序列表青岛农业大学一种KLP1基因在提高植物抵抗灰霉菌侵染中的应用 17 SIPOSequenceListing 1.0 1 442 DNA 番茄(Solanum 。

28、lycopersicum) 1 atgggtttga atggcaagtt ggttgtttcg atggaggtta agtgtggagg acacttgttt 60 catgaccttt atcaaactag ttctcatcat gtaactaaca taagttcaga caaagtccat 120 cattttgata ttcacgaagg tgaagatcta agagctggtt caataattgg ctggaaatat 180 acccatgatg gaaaagttaa ggttactaag caattgattg aagccgttga tgaagagaag 240 aaatc。

29、aatta cttggaaagt tttagaggga gatacgttgg aattgtacaa ttctttcact 300 attagtgcat cttttgaaga caattgggca acatggacat ttgtgtatga aaagaaaact 360 aagacacacc agaacccgtc actcttctga agcttatgat cgatattacc agagatttaa 420 gggtcacctc cacaagattt aa 442 2 147 PRT 番茄(Solanum lycopersicum) 2 Met Gly Leu Lys Gly Lys Leu I。

30、le Ala Ser Val Glu Met Lys Cys Gly 1 5 10 15 Glu Gly Ser Phe Phe Asp Ile Phe His Ile Asn Thr Asn Gln Val Pro 20 25 30 Asn Ile Ser Pro Lys Asn Ile Val His Phe Gly Ile His Glu Gly Glu 35 40 45 Ser Val Lys Thr Gly Ser Ile Val Ser Trp Lys Tyr Asn Glu Ala Gly 50 55 60 Gln Glu Met Tyr Met Lys His Leu Ile 。

31、Glu Ala Ala Asp Pro Gln Gln 65 70 75 80 Lys Leu Ile Lys Trp Lys Val Ile Glu Gly Asp Leu Leu Lys Leu Tyr 85 90 95 Lys Tyr Cys Asn Phe Thr Thr Ser Cys Asp Gly Gln Trp Thr Thr Trp 100 105 110 Thr Ile Asp Tyr Glu Lys Lys Thr Glu Asp Thr Pro Glu Pro Leu Leu 序列表 1/5 页 8 CN 111549038 A 8 115 120 125 His Le。

32、u Gly Val Ile Leu Ala Met Thr Lys Asp Ile Glu Ser His Leu 130 135 140 Leu Lys Lys 145 3 25 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 3 atgggtttaa aaggtaagtt gattg 25 4 23 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 4 aatcttgtgg aggtgaccct cta 23 5 22 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 5 gctggttcaa taattggctg ga 22 6 20 DNA 人工序列(A。

33、rtificial Sequence) 6 aagagtgacg ggttctggtg 20 7 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 7 ttgctgaccg tatgagcaag 20 8 20 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 序列表 2/5 页 9 CN 111549038 A 9 8 ggacaatgga tggaccagac 20 9 1588 DNA 番茄(Solanum lycopersicum) 9 tgggtttgaa tggcaagttg gttgtttcga tggaggttaa gtgtggagga cacttgt。

34、ttc 60 atgaccttta tcaaactagt tctcatcatg taactaacat aagttcagac aaagtccatc 120 attttgatat tcacgaaggt gaagatctaa gagctggttc aataattggc tggaaatata 180 cccatggtaa gactcgtatc gctataattt tgtggattat ttgagggttt tttgaaaact 240 ttttttagtt aaagagtagc cttggaacac cgtaaaagtc gtcattgata cttgtattac 300 gatataatgt ct。

35、atatcata ttctgttgtc aaattttata gtctgtttgg acaacctttt 360 aaaaataaga aatgtttttt atacttttcc aaaagttatt taaaaaattt aaaattagga 420 taaaaaatta gcatgtgact tagaagtgtt gctcactttc ctgtgggaag ggcatgatta 480 tagtttggaa cattttacat gccccttctt ttcatatggg taaaattatt ttattctttc 540 taatttttat tattacatat ggtgtttttt 。

36、ttttgcttcg gttatcataa attttgtcgt 600 tgttattgtt ctttttttca ataatgtttg tatgacttgt tcaccgtttt attttgtttt 660 taaggttgct ttgaaatatt ttatttgact taagagtaat ttattagaaa caactctgtt 720 atcttcacaa gatagatatg atttgtatat acatcatcct ctccatatcg tatttgtgat 780 ttgacactaa gtatgttatt gttaaggtat ttgaccagac ttttaagaa。

37、a aaacaagtga 840 tttagttttg agtgatatca aaagttattt ttcaaaagcc agaaagatta ggttttctcc 900 aaaaatattt ctaaaatatt ggtcaagcac aaaatactgc tccaatattg acaaaaatat 960 ttttcaaaaa tttataagtc atacacaaag tatttacaag gtcaaacatg ctattagtca 1020 tgtaatttac cattgagata ctgttgatta aaaaaaaaca attttcacaa catgcaattt 1080 t。

38、taagaaatt gaccaaacat gctattggtt atataattta tggttattga tgataaattt 1140 tagtagctta atgttattgt gcatcacaaa gttttaaatt tttcttccta tccattttcc 1200 ataagtttct aattcagtca aacaatatta cataaattga gacaaaagaa atatatttta 1260 ggataaatta gataattgag atagaattaa tttctttctt tttttcgtaa ctttttaaaa 1320 aataattaca gatgga。

39、aaag ttaaggttac taagcaattg attgaagccg ttgatgaaga 1380 gaagaaatca attacttgga aagttttaga gggagatacg ttggaattgt acaattcttt 1440 cactattagt gcatcttttg aagacaattg ggcaacatgg acatttgtgt atgaaaagaa 1500 aactgaagac acaccagaac ccgtcactct tctgaagctt atgatcgata ttaccagaga 1560 tttagagggt cacctccaca agatttaa 15。

40、88 10 56 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 10 序列表 3/5 页 10 CN 111549038 A 10 atatatggtc tcgtttgaag gtgaagatct aagagcgttt tagagctaga aatagc 56 11 57 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 11 attattggtc tcgaaacgaa cccgtcactc ttctgaacaa actacactgt tagattc 57 12 24 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 12 agcggataac aatttca。

41、cac agga 24 13 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 13 gcaggcatgc aagcttattg g 21 14 25 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 14 atgggtttaa aaggtaagtt gattg 25 15 26 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 15 cgatatggag aggatgatgt atatac 26 16 21 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 16 accgttccag agttgactca a 21 17 21 序列表 4/5 页 11 CN 111549038 A 11 DNA 人工序列(Artificial Sequence) 17 gcaagaaagc ctttcttctg a 21 序列表 5/5 页 12 CN 111549038 A 12 图1 图2 图3 说明书附图 1/3 页 13 CN 111549038 A 13 图4A 图4B 说明书附图 2/3 页 14 CN 111549038 A 14 图5 说明书附图 3/3 页 15 CN 111549038 A 15 。