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一种高海拔地区羊肚菌原种制作液体培养基及原种制作方法

来源：花匠小妙招时间：2025-06-16 13:12

1.本发明涉及一种高海拔地区羊肚菌原种制作液体培养基及原种制作方法。

背景技术：

2.羊肚菌菌种制作一般通过母种活化、原种制作、栽培种扩繁三个步骤，现有技术中常采用固体培养基进行原种制作。羊肚菌菌丝相较于其他食用菌而言，生长速度较快，但容易老化退化。且目前羊肚菌从母种活化到原种需要25-30天，栽培种需要45-50天，生产效率低下。

技术实现要素：

3.为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供了一种高海拔地区羊肚菌菌种制作方法。本发明通过对传统原种制作步骤进行改变，从使用固体培养基转变为使用液体培养基，将原种改为液体菌种，可以有效降低成本，缩短制种周期：用本发明方法扩繁，可在10-11天内得羊肚菌原种，30-35天得栽培种，极大程度地提高生产效率。通过本发明制作的羊肚菌原种菌龄一致，菌丝活力强。
4.本发明提供一种高海拔地区羊肚菌原种制作液体培养基，所述液体培养基由一级液体菌种液体培养基和二级液体菌种液体培养基组成；所述一级液体菌种液体培养基的配方如下：按比例每升培养基含玉米淀粉10-15g、酵母粉2.4g、麸皮46-60g、葡萄糖15-25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5；所述二级液体菌种液体培养基是在一级液体菌种液体培养基中加入重量百分比为0.9%的羧甲基纤维素钠。
5.作为优选方案，所述一级液体菌种液体培养基的配方如下：按比例每升培养基含玉米淀粉10g、酵母粉2.4g、麸皮60g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
6.作为优选方案，所述一级液体菌种液体培养基的配方如下：按比例每升培养基含玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮50g、葡萄糖15g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
7.作为优选方案，所述一级液体菌种液体培养基的配方如下：按比例每升培养基含玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮46g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
8.本发明还提供一种高海拔地区羊肚菌原种制作方法，包括以下步骤：（1）羊肚菌一级液体菌种的获得：每100ml上述的一级液体菌种液体培养基接种三粒直径4.8-5.2mm的羊肚菌母种，摇床18℃，180-200转/分钟培养3-5天，得到羊肚菌一级液体菌种；（2）羊肚菌二级液体菌种的获得：按照10%-15%接种量将一级液体菌种接种于放有
上述的二级液体菌种液体培养基的发酵罐内，接种后静置黑暗培养1天，然后在通气量3.5-4.0l/min，ph自然，转速300-350转/分钟，15-18℃的条件下再培养5-6天，得到羊肚菌二级液体菌种。
9.作为优选方案，包括以下步骤：（1）羊肚菌一级液体菌种的获得：每100ml上述的一级液体菌种液体培养基接种三粒直径5mm的羊肚菌母种，摇床18℃，180转/分钟培养5天，得到羊肚菌一级液体菌种；（2）羊肚菌二级液体菌种的获得：按照10%接种量将一级液体菌种接种于放有上述的二级液体菌种液体培养基的发酵罐内，接种后静置黑暗培养1天，然后在通气量4.0l/min，ph自然，转速300转/分钟，18℃的条件下再培养5天，得到羊肚菌二级液体菌种。
10.本发明还提供一种高海拔地区羊肚菌菌种制作方法，包括上述的高海拔地区羊肚菌原种制作方法。
11.作为优选方案，所述海拔为1900-2300米。
12.本发明提出了一个针对羊肚菌最佳生长条件的液体培养基及原种制作方法，用此方法扩繁，在10-11天内即可得羊肚菌原种，30-35天可得栽培种，每毫升菌丝可达10.8-14.9g，菌丝球直径均在2mm以下。该方法适用于高海拔地区羊肚菌的快速扩繁。
附图说明
13.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：图1为本发明的羊肚菌原种。
14.图2为本发明的羊肚菌原种一次发酵。
具体实施方式
15.以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
16.本发明通过对羊肚菌菌种制作过程中原种制作步骤进行优化，从使用固体培养基转变为使用液体培养基，有效降低成本、提高生产效率、缩短制种周期，经此方法扩繁10-11天即可制得羊肚菌原种，30-35天可得羊肚菌栽培种。
17.本发明的羊肚菌菌种制作过程中原种制作步骤使用的液体培养基配方如下：一级液体菌种液体培养基：按比例每升培养基含玉米淀粉10-15g、酵母粉2.4g、麸皮46-60g、葡萄糖15-25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
18.二级液体菌种液体培养基：在一级液体菌种液体培养基中加入重量百分比为0.5%的羧甲基纤维素钠 [c6h7o2(oh)2och2coona]n。
[0019]
羧甲基纤维素钠水解之后的纤维素是细胞壁的主要组成成分，可以提供碳源，有效增加活力，加速细胞生长。
[0020]
本发明主要通过改变玉米淀粉、麸皮、葡萄糖的比例调整配方的c/n，经调试，本配方的c/n约为20-30：1，符合羊肚菌生长的营养需求。
[0021]
本发明通过控制配方的c/n对玉米淀粉、麸皮、葡萄糖的用量进行调整，c/n设置三
个梯度：
①
20：1、
②
25：1、
③
30:1；配方分别如下：
①
玉米淀粉10g、酵母粉2.4g、麸皮60g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0022]
②
玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮50g、葡萄糖15g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0023]
③
玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮46g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0024]
本发明的羊肚菌菌种制作过程中原种制作步骤使用的液体培养基的制备方法为：
①
麸皮称好用两层纱布包裹，沸水中煮制20分钟，过滤，滤液备用；
②
玉米淀粉用蒸馏水化开，加入麸皮过滤液中，边加边搅拌，小火煮制5分钟，4层纱布过滤两次，滤液备用；
③
取酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾（二级液体菌种液体培养基还包括羧甲基纤维素钠），用蒸馏水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，小火加热，煮制1分钟，加去离子水至足量；
④
用精密ph试纸检测，ph5.5左右即可，否则用1 mol/l的naoh溶液或hcl溶液调整；
⑤
分装，115℃灭菌30分钟。
[0025]
使用本发明的上述液体培养基进行羊肚菌原种制作的方法为：1.一级液体菌种的获得：每100ml上述一级液体菌种液体培养基接种三粒直径5mm左右的羊肚菌母种，摇床18℃，180-200转/分钟培养3-5天，得到羊肚菌一级液体菌种。
[0026]
羊肚菌为低温菌，培养温度过高，菌丝生长速度极快，但细而弱，不利于生产。
[0027]
2.二级液体菌种的获得：按照10-15%接种量将一级液体菌种接种于放有二级液体菌种液体培养基的发酵罐内，接种后静置黑暗培养1天，然后在通气量3.5-4.0l/min，ph自然，转速300-350转/分钟，15-18℃的条件下再培养5-6天，得到羊肚菌二级液体菌种。
[0028]
在上述条件下得到的羊肚菌原种，羊肚菌菌丝干重可达10.8-14.9gmg/ml，菌丝球直径均在2mm以下。
[0029]
菌丝干重的计算方法为：取均匀发酵羊肚菌原种10ml，样品取3次重复，离心机3000转/分钟离心5分钟，弃上清液，蒸馏水冲洗，再离心，再冲洗，重复5遍；烘干机65℃烘干至恒重，称量，再换算。
[0030]
实施例1试验于临夏回族自治州农业科学院和河州云菇农业科技有限公司的实验室内开展，海拔2010～2035米。
[0031]
本发明的一种高海拔地区羊肚菌菌种制作方法包括以下步骤：一、羊肚菌母种活化1. 活化培养基配方：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁 1g，琼脂粉20g，ph 7，补水至1000ml。
[0032]
2. 活化培养基的制备：
①
马铃薯洗净去皮，称取200g，切成1cm3大小的方块，300ml蒸馏水煮开，加入马铃薯块，小火煮20分钟左右，煮至马铃薯块用玻璃棒能戳开但不散为宜，四层纱布过滤两次，
留滤液备用；
②
称取葡萄糖20g、蛋白胨3g、磷酸二氢钾3g、硫酸镁 1g，用200ml蒸馏水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，备用；
③
称取20g琼脂粉，用200ml蒸馏水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，均匀后小火加热，煮沸后1分钟关火，补水至1000ml，ph调至7，搅拌均匀，分装；115℃灭菌30分钟；
④
平板制备：10cm直径的玻璃培养皿提前灭菌备用，超净工作台紫外照射30分钟备用；培养基灭菌结束后迅速转移至超净工作台中，操作人员双手用肥皂清洗干净，伸入超净工作台后再用酒精棉擦拭消毒，等酒精晾干后点燃酒精灯，开始倒平板，每个平板倒培养基约15ml左右，即厚0.5cm左右即可，倒完后培养皿放在超净工作台中冷却，再次紫外照射30分钟。
[0033]
检测：等培养皿中的冷凝水散尽后封口，在室温放置3天，若无杂菌生长即可使用。
[0034]
3. 活化：取羊肚菌菌种0.5cm2大小的带菌丝琼脂块，置于步骤2制备的活化培养基中央，平板倒置，恒温培养箱内18℃培养5天，得到活化后的羊肚菌母种。
[0035]
二、羊肚菌原种制作（液体培养）1.液体培养基配方：一级液体菌种液体培养基：按比例每升培养基含玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮46g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0036]
二级液体菌种液体培养基：在一级液体菌种液体培养基中加入重量百分比为0.5%的羧甲基纤维素钠 [c6h7o2(oh)2och2coona]n。
[0037]
2. 液体培养基的制备：
①
麸皮称好用两层纱布包裹，沸水中煮制20分钟，过滤，滤液备用；
②
玉米淀粉用蒸馏水化开，加入麸皮过滤液中，边加边搅拌，小火煮制5分钟，4层纱布过滤两次，滤液备用；
③
取酵母粉、葡萄糖、蛋白胨、硫酸镁、磷酸二氢钾（二级液体菌种液体培养基还包括羧甲基纤维素钠），用蒸馏水化开，加入上一步滤液中，边加边搅拌，小火加热，煮制1分钟，加去离子水至足量；
④
用精密ph试纸检测，ph5.5左右即可，否则用1 mol/l的naoh溶液或hcl溶液调整；
⑤
分装，115℃灭菌30分钟。
[0038]
3.一级液体菌种的获得：每100ml液体培养基接种三粒直径5mm的羊肚菌母种，摇床18℃，180转/分钟培养5天，得到羊肚菌一级液体菌种。
[0039]
4.二级液体菌种的获得：按照10%接种量将一级液体菌种接种于放有二级液体菌种液体培养基的发酵罐内，接种后静置黑暗培养1天，然后在通气量4.0l/min，ph自然，转速300转/分钟，18℃的条件下再培养5天，得到羊肚菌二级液体菌种。
[0040]
在上述条件下得到的羊肚菌原种，羊肚菌菌丝干重达到14.9mg/ml，菌丝球直径在1.5mm以下。
[0041]
图1为本发明的羊肚菌原种。
[0042]
图2为本发明的羊肚菌原种一次发酵。
[0043]
三、羊肚菌栽培种接种及培养以每500g栽培料3.5ml羊肚菌二级液体菌种接种，于18℃直立培养10-20天。
[0044]
栽培料可以选择市售的羊肚菌栽培料。
[0045]
实施例2本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤二中羊肚菌原种液体培养基原料配比不同，本实施例中的培养基原料配比为玉米淀粉10g、酵母粉2.4g、麸皮60g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0046]
在上述条件下得到的羊肚菌原种菌丝干重可达10.8mg/ml，菌丝球直径在2mm以下。
[0047]
实施例3本实施例与实施例1的不同之处在于：步骤二中羊肚菌种液体培养基原料配比不同，本实施例中的培养基原料配比为玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮50g、葡萄糖15g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。
[0048]
在上述条件下得到的羊肚菌原种菌丝干重可达12.2mg/ml，菌丝球直径在1.5mm以下。
[0049]
对比例本对比例与实施例1的不同之处在于：步骤二中羊肚菌二级液体菌种液体培养基原料配比不同，本对比例中的二次发酵培养基原料配比为：玉米淀粉15g、酵母粉2.4g、麸皮60g、葡萄糖25g、蛋白胨2.5g、硫酸镁0.5g、磷酸二氢钾1g，ph 5.5。其余步骤与参数均与实施例1相同。试验发现单一碳源发酵的效果不及复合碳源，不添加羧甲基纤维素钠时二次发酵后菌丝生物量仅为10.3g/ml。
[0050]
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。