《微生物基础技术》微生物菌种保藏方法大全，收藏!!!

　　一万个为什么涌上脑海，为什么微生物可以低温、干燥缺氧、避光的环境中保藏？我们人类是不是也可以？对的，就是这么一个念头，世界上第一位冷冻人出现了。

　　1962年，被誉为人体冷冻之父的RobertEttinger在书中说道，死亡是一个渐进的进程，假如身体被冻得足够快，死亡是能够反转的。书中引述了很多关于低一级动植物「冷冻复生」的案例，罗伯特博士认为，作为高级生物的人类，肯定也具有了「冷冻复生」的潜力。这本书一经出书，就引起了不小的轰动。

　　天哪，怎么可能不引起轰动，如果人类可以沿用低等生物冷冻复生的能力，那我也想试试。万一成功了呢？但是事实呢？微生物在冷冻缺氧的环境中处于休眠状态，人呢？估计是透心凉了吧。

　　1967年1月12日，詹姆斯永远地停止了呼吸。他们先为詹姆斯洗了个冷水澡，好让詹姆斯的身体在冰浴中冷却。接着抽干了他体内一切的血液，并为詹姆斯注射了很多二甲基亚砜，这是一种当时被认为行之有效的冷冻保护剂。就这样缓慢的冷却三天后，他们把詹姆斯的遗体塞在一个聚苯乙，烯泡沫塑料盒中，临时存放在一个车库里。

　　詹姆斯停止呼吸后才进行了冷却，加入二甲基亚砜保护剂，跟微生物保藏菌种相比，似乎不太一样，我们总不能让微生物死亡后保种吧？当然，这只是一个比喻。需要说明的是，万事万物需要遵循事物的客观规律，不能强求，我想长一身毛暖和点，就长一身毛，好像也不合适，夏天怎么办？雪见的头发比草长得快，吓人不？以后的多少年后，可能人体冷冻技术确实可能存在，技术革新日新月异，一切皆有可能。但我们复杂的机制和构造，跟简单的低等生物相比，应该是一个不小的挑战。言归正传，在冷冻人体试验中，我们能获取到的是，需要保护剂，同样，微生物保藏也需要保护剂，没有保护剂的作用，微生物也会冻死。

　　一、微生物菌种保藏的目的

　　尽可能的保持菌种的原有性状和活力，不变异、不死亡、不污染、不退化。菌种保藏最重要的目的就在于如何保持优良菌种其优良性状的稳定，满足生产的实际需要。

　　解析：但是可能吗？不可能的，只能在现有技术的提前下，最大可能的保持原有性状和活力。如果保藏时间过长，还有会有部分死亡。

　　二、微生物菌种保藏的原理

　　1使微生物的代谢作用降至极低限度，使其处于不活泼的休眠状态。通过降低微生物体内的代谢，抑制生长繁殖，从而延长菌种的生命，减少变异。

　　2从微生物本身来说，就是要挑选典型菌种的优良纯种，最好采用他们的休眠体，比如说芽孢、孢子等。从环境条件来说，就是要创造一个适合长期休眠的环境条件，比如低温、干燥。缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度中和剂等。大多数菌种的保藏方法都是根据这些因素或其中部分因素设计的。

　　3微生物具有易异变的特性，在保藏过程必须使微生物代谢处于最不活跃的状态但又不死亡，才能在一定的时间内使其不发生变异而又保持生命力。

　　解析：保藏菌种的时候，要选择优良的纯种，确保菌种是单一菌种，没有老化状态，也没有出现其他不合适的性质出现。选择合适的保护剂，保护菌种在低温、干燥等的环境下处于休眠状态非死亡状态。保藏菌种也需要及时传代，不能保藏起来一直不管不过，几十年后拿出来就想用，想什么呢？最不活跃的状态，也不是死亡，还是会发生变化的。

　　三、微生物菌种的保藏方法主要包括以下几种：

　　1斜面保藏法

　　方法：将菌种接种到事先准备好的固体斜面培养基上，恒温培养箱中培养，待斜面菌种生长成熟后放置于4℃冰箱保藏。

　　对象：细菌、放线菌、酵母、丝状真菌等的短期保藏。

　　解析：一般两个月内不使用，也可能使用的菌种。

　　保藏时间：一般为两个月，最好不超过两个月。时间过长，斜面脱水，菌种也会脱水死亡。

　　解析：一般情况，细菌一个月，酵母菌、放线菌等两个月。

　　优点：操作简便，不需要特殊设备，成本低，容易观察，随时观察菌种的状态，复苏方便。

　　解析：斜面材质一般是玻璃，透明，可以定期观察菌种变化，如果发现污染或斜面脱水等状况，立即转种。

　　缺点：保藏期短，菌种容易变异，易污染。

　　解析：因斜面上只有固体培养基，没有特殊的保护措施，所以培养基本身会发生变化，因保藏期短，就需要经常传代，传代过程中增加污染的机会。

　　活化方法：斜面保藏法活化菌种比较简单，直接用接种环挑取一环，采用三区划线法在平板培养基上划线，适宜温度下培养即可。

　　2甘油管保藏法

　　方法：首先准备50%的甘油溶液，一般采用质量比配制，使用时，菌液和甘油比例1:1混合，-80℃保藏即可。或者按照甘油终浓度20%-30%保种。

　　解析：甘油能够提高水体的黏稠度，使其冰点提高，防止细胞内部产生冰晶造成细胞的损害，通常使用甘油的终浓度在20%~30%，该范围外的浓度会对细胞产生毒性，质粒会很容易丢失，甘油浓度太低起不到作用，太高又会影响菌种活性。

　　对象：中长期保藏菌种。

　　解析：半年到一年内可能用到的菌种

　　保藏时间：一般保藏时间为一年。

　　解析：实际操作中，一年以上也没问题。

　　优点：操作简单，保藏期较长，菌种不容易发生变异。

　　缺点：不容易观察，不易监测菌种变化，不宜反复冻融。

　　活化方法：将甘油管取出，逐渐融化，直接用接种环挑取一环，采用三区划线法在平板培养基上划线，适宜温度下培养即可。或者用无菌水适当稀释后涂布至平板培养基中，培养。

　　3穿刺保藏法

　　方法：事先备好半固体培养基，用接种针挑取单菌落，从半固体培养基的中心垂直刺入，直至接近试管底部，不要穿透，然后沿原穿刺线将接种针退出，穿入培养基若干次，放置于恒温培养箱中培养，于4℃冰箱保藏。

　　解析：半固体培养基琼脂粉浓度0.3%-0.5%，培养基为无菌试管中至约1/3。营养不宜太丰富。

　　保藏时间：一般3-6月后转种。

　　解析：有的菌种保存时间至少可以达到1年，有的菌种甚至能达到20年之久。

　　对象：适用于工程大肠杆菌等细菌，操作简便，保存时间较长

　　优点：操作简便，保存时间比斜面保藏法长

　　缺点：比较耗费空间，不便于携带

　　活化方法：用接种环沿着菌种方向穿入，挑取菌种，转接至斜面上或平板培养基上，或加入无菌水摇晃，稀释涂布即可。

　　4液体石蜡保藏法

　　方法：斜面保藏法的一种改进，只需将无菌干燥的液体石蜡注入上述培养好的斜面至高于斜面顶端1cm处，再将试管密封，直立于4℃左右冷藏保存。

　　解析：覆盖灭菌的液体石蜡，一方面可防止因培养基水分蒸发而引起菌种死亡，另一方面可阻止氧气进入，以减弱代谢作用。要定期添加石蜡保证斜面处于液面以下。

　　保藏时间：保藏时间至少可以达到1年，甚至更长。

　　对象：细菌，酵母菌等

　　优点：保藏时间较长

　　缺点：比较耗费空间，不便于携带

　　注意事项：液体石蜡易燃，必须注意火灾；移植菌种时，接种针上带有石蜡和菌体，火焰灭菌时易飞贱、爆发，严防感染。

　　5沙土管保藏法

　　方法：将菌种接种到事先准备好的固体斜面培养基上，恒温培养箱中培养，以便形成大量的孢子。当孢子成熟后，用无菌水洗下制成孢子悬液，然后加入无菌的沙土管中，通过减压干燥的方式去除沙土管中水分，直至水分被抽干，最后用石蜡或橡胶塞封口。

　　解析：沙土管主要是通过创造干燥和寡营养的条件来保藏菌种。操作的时候应该注意抽干一步务必要快，尽量在12h内完成，防止孢子萌发，降低保藏效果。

　　保藏时间：两年左右

　　解析：根据菌种特性，保藏时间可能更长。

　　对象：适用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌。

　　解析：能形成芽孢的芽孢杆菌也可以采用该方法。

　　优点：保藏效果好，适用性也较广泛

　　解析：在抗生素生产工厂应用广泛。

　　缺点：不能保藏营养细胞

　　6冷冻真空干燥保藏法

　　操作方法：将处于成熟期的微生物培养物悬浮于无菌的血清、卵白、脱脂奶或者海藻糖等保护剂中制成浓菌液，分装到无菌的安瓿瓶中，于低温冰箱中冷冻，达到预定温度后对浓菌液进行冷冻干燥处理，之后在真空状态下融封安瓿瓶，于20℃保藏。

　　解析：该方法是将菌种冷冻，在减压下利用升华作用去除水分，使细胞的生理活动趋于停滞。

　　保藏时间：五到十年。

　　解析：因保藏期较长，一定要标记清楚，以免遗忘。

　　对象：适用于大批量菌种的长期保存

　　优点：适用范围广，保藏效果好，存活率高，变异小，便于携带。

　　解析：该保藏法是目前适用范围最广，保藏效果，好，的方法，如果需要长期保藏就选择这种方法。

　　缺点：操作复杂，成本高

　　解析：因涉及到冷冻抽真空设备，一般实验室不具备条件，需要到专门保藏机构保藏，成本增加。

　　活化方法：（1）安瓿瓶开封先用浸过75%酒精的脱脂棉擦净安瓿管，用酒精灯火焰将安瓿管顶端适度加热，然后用移液器取少量无菌水，将无菌水滴至加热的安瓿管顶端使玻璃开裂，最后用挫刀或镊子敲下已开裂的安瓿管的顶端。

　　（2）复活方法先用移液器吸取0.3-0.5mL适宜的液体培养基，滴人安瓿管内，轻轻振荡，使菌体溶解呈悬浮状，然后取0.1-0.2mL菌体悬浮液，移植于适宜的斜面或平板培养基上，剩余的菌液，注入适宜的液体培养基内，适宜的温度下培养。

　　7液氮超低温保藏法

　　操作方法：离心收集对数生长期微生物细胞，用新鲜的培养基重悬微生物细胞，然后加入等体积的20%甘油，或10%DMSO等保护剂，混匀后分装至安瓿瓶中，缓慢预冷，最后移至液氮罐中的液相（-196℃）或气（-156℃）作长期超低温保藏。

　　解析：甘油一般用高压蒸汽灭菌，二甲亚砜一般用过滤除菌。

　　对象：所有微生物

　　保藏时间：15年以上或更长

　　优点：适用性广，保藏期长

　　缺点：操作复杂，成本高

　　四、菌种保藏共同点

　　1严格无菌操作。尤其是后面两种方法，花费那么大精力、物力和财力，最后保藏的杂菌，扪心自问一下，亏不亏？

　　2所保藏的微生物在保藏时处于良好的状态。

　　解析：不能跟前面詹姆斯一样，一定要最，好，的状态。

　　3防止退化的发生。所以，保藏期一到，准备转接重新保种。

　　总之，菌种保藏是微生物学的重中之重，根据微生物的习性和使用时间，选择合适的保藏方法，在后期的文章中也会陆续提及，慢慢细化，敬请期待……

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