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甘油菌种复苏保存步骤与注意事项

来源：花匠小妙招时间：2025-06-13 18:45

　　在微生物学研究及其工业应用中，甘油菌种的复苏和保存尤为重要。甘油作为一种常用的保护剂，具有出色的维持菌种活性和稳定性的能力。这一特点使其在微生物保存过程中得到了广泛应用。然而，复苏和保存的细节及注意事项直接影响菌种的存活率以及后续实验的成功与否。因此，熟悉甘油菌种复苏和保存的正确步骤与关键注意事项，对于检测人员来说，具有重要的现实意义。

　　首先，甘油菌种的保存通常采用低温冷冻的方法。将菌种与一定比例的甘油混合后，迅速冷冻至-80℃或更低的温度，以确保菌种在低温下的长期稳定性。在这个过程中，甘油的浓度、混合均匀性以及冷冻速度都是影响保存效果的重要因素。

　　其次，菌种的复苏过程同样需要精心操作。复苏时，应将冷冻的菌种迅速解冻，并在适宜的培养基中进行培养。解冻过程中，温度的控制和时间的把握至关重要，过快或过慢的解冻速度都可能导致菌种的损伤。此外，复苏后的菌种应尽快转移到新鲜的培养基中，以恢复其生长活性。

　　在整个复苏和保存过程中，还需要注意无菌操作，避免外界污染对菌种的影响。同时，定期检查保存的菌种，确保其活性和纯度，也是保证实验结果可靠性的关键。

　　1.甘油菌种复苏保存步骤

　　甘油菌种的复苏保存是一个关键的过程，需要经历几个重要步骤。首先，在菌种保存阶段，应将菌种接种于LB液体培养基，并在培养体系内浑浊可见时进行保存。接着，要准备50%浓度的甘油溶液，确保在无菌条件下将菌液与甘油按1:1的比例混合，使甘油终浓度达到25%，然后保存在-20°C冰箱内。

　　如果需要长期保存，建议在-70°C或-80°C下冻存。在菌种复苏阶段，需要在30°C水浴中解冻保存的菌种，并接种到固体培养基上，在适宜条件下培养以恢复菌种的活性。最后，再次保存时，复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，并进行甘油保存，以确保菌种的长期保存和可用性。

　　在整个过程中需要注意的是，确保所有使用的工具和容器都经过适当的灭菌处理，保持无菌条件，以避免污染。正确的保存和复苏方法对于保持菌种的活性和纯度至关重要，且保存温度对菌种的长期存活有显著影响，低温有利于延长保存时间。

　　甘油菌种的复苏和保存的详细的步骤及注意事项：

　　菌种保存步骤

　　准备培养基：将菌种接种于LB液体培养基中，并在对数生长期（培养体系内浑浊可见时）进行保存。

　　制备甘油溶液：准备50%浓度的甘油溶液，可以通过等体积的蒸馏水和甘油混合得到。

　　混合菌液和甘油：在无菌条件下，将菌液与50%浓度的甘油按1:1的比例混合，使甘油终浓度达到25%。

　　保存菌种：将混合液转移至2mL离心管中，并在-20°C冰箱内保存。这种条件下，菌种的保存有效期为1年。若需长期保存，建议在-70°C或-80°C下冻存，保藏时间一般为2-4年。

　　菌种复苏步骤

　　解冻：在使用前，将保存的菌种在30°C水浴中解冻。

　　接种培养：解冻后，将菌液接种到固体培养基上，并在适宜条件下培养24-48小时，以恢复菌种的活性。

　　再次保存：复苏后的菌种可以在新的液体培养基中继续培养，并再次进行甘油保存。这一过程确保了菌种的长期保存和可用性。

　　注意事项

　　选择合适的培养基

　　勿使用选择性培养基。一般使用非选择性的增菌培养基，因为微生物在选择性培养基中生长某些生物特性可能丢失，保藏的菌种的生物特性可能与标准菌株特性不同。

　　菌液的浓度

　　菌液的浓度一般越大，菌种保存时间越长。保藏时细菌常使用菌液，霉菌常用无菌水或生理盐水制备成的孢子悬液。、

　　甘油浓度

　　甘油终浓度一般为10%~20%。由于甘油原液太粘稠，需要配制合适的甘油-水溶液，将菌悬液与甘油以1:1的体积比充分混匀后，分装至提前灭菌好的保藏管中，-80℃（-70℃）冰箱保存。

　　反复使用

　　对菌种进行保藏时注意“慢冻快化”，冷冻时降温速率保持1℃/min,复苏时用37℃水浴融化，能够保证菌种最大的成活率。当冷冻菌种融化后，应避免再次冷冻，否则菌体的生存率会大幅度降低。

　　保存时间

　　该方法适合中长期菌种保藏，保藏时间一般为2-4年左右。

　　核查验证

　　每半年进行一次菌种确认试验，通过平板划线分离、观察菌落形态、染色镜检等常规实验检测细菌的存活情况。若有条件，可用菌株生化鉴定试剂盒进行确认。

　　保存的温度对菌种的长期存活有很大影响，低温条件有利于延长保存时间。

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