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一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌LW

来源：花匠小妙招时间：2025-05-19 15:26

本发明涉及一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌lw-6的制备及应用，属于微生物技术领域或者生物防治技术领域。

背景技术：

烟草是重要的经济作物，其生长过程受到很多病害的危害，其中烟草根结线虫病为主要的土传病害，造成烟草的减产或绝收。根结线虫(meloidogynespp.)是一类植物内寄生线虫，无严格的宿主特异性，能侵染多种农作物，严重危害农业生产，每年造成全球数千元亿美元的损失。根结线虫在全世界广泛分布，寄主范围广泛，它除直接危害外，还能传播细菌和真菌病害，造成许多经济作物的更大损失。在我国，随着烟草连载面积的扩大以及连作时间的延长，土壤传播的根结线虫病危害日趋严重，成为烟草生产的主要限制因素之一，导致烟叶减产和烟叶质量降低。根结线虫病的防治目前多采用化学防治、轮作及抗病品种，但效果均不太理想，且存在诸多弊端。如目前使用的化学杀线虫剂多为剧毒或高毒、高残留农药，对土壤微生物、植物、水源和大气层带来严重污染或破坏，同时病菌和线虫抗药性问题也日益突出，而且药物在植物体内残留会间接对人类造成危害。因此急需开发对环境友好，对人畜无毒的防治线虫病害的有益微生物菌剂。

本发明利用现代生物工程、发酵工程技术，用优选的培养基、发酵液配方及工艺制备而成，本发明弥补上述技术空缺，以根结线虫生物防治和提高烟草作物的产量为目的一种甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂的制备及应用，本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂是一种高效绿色的生防菌剂，具有防治烟草根结线虫以及烟草促生的功效。本发明甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂，是以所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6经优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的lw-6菌剂，活孢子数可达50亿/ml，且本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6对抗逆性强，生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显等特点，对人畜无毒及对环境友好，而且和现代的滴灌技术相结合，具有使用简单的特点。因此，本发明在新的生物农药研发方面和应用方面都具有重要的理论和实践意义。

技术实现要素：

第一目的在于提供所述的用于烟草根结线虫生物防治和促生的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂及其使用技术；第二目的在于提供所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂的制备方法。

甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌株的获得：

甲基营养型芽孢杆菌lw-6(bacillusmethylotrophilus)，保藏单位为：cgmcc—中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所；保藏编号为：cgmccno.6793；保存时间：2012年11月07日，且检测结果为存活。

本发明的第一目的和第二目的是这样实现的，

所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6对抗逆性强、生长繁殖快、抗高温耐干旱，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显。

本发明的第二目的是这样实现的，是以所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6经优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的lw-6菌剂，活孢子数可达50亿/ml，具体包括：

(1)平板活化和优选培养：将甲基营养型芽孢杆菌lw-6原种斜面接种到平板培养基上活化，平板培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨3.5％，酵母浸膏1.3％，nacl1.5％，琼脂粉5.7％，葡萄糖0.9％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，ph为7.2～7.3,培养条件为:在温度为32℃下培养80h。

(2)种子培养：将活化的平板菌种接种到优选液体培养基中，在温度为32℃下培养80h，得发酵种子液；其中所述的液体培养基的成分及其重量百分比为：蛋白胨3.5％，酵母浸膏1.4％，nacl1.8％，葡萄糖00.9％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，ph为7.2～7.3。

余量为水，ph为7.2～7.3。

(3)发酵：将发酵种子液按发酵培养基体积8％的量接种入发酵罐，在32℃下培养80h，搅拌速度为180rpm，通气量11％，在检测到活孢子数≥50亿活孢子/ml的时候，停止发酵，即得到甲基营养型芽孢杆菌lw-6发酵菌液；其中所述的发酵培养基的成分及其重量百分比为：豆饼粉2.4％，可溶性淀粉2.3％，酵母浸膏1.8％，葡萄糖0.9％,nacno30.05％、caco30.28％，碳酸钠0.1％，硫酸镁0.1％，硫酸铁0.1％，余量为水，ph为7.2～7.3。

(4)菌液浓缩、菌剂制备及剂型加工得到目标菌剂：将发酵液进行超滤浓缩，去掉42％水分；然后在浓缩发酵液中添加7％的轻钙载体充分混匀，然后进行低温干燥。将低温干燥菌粉加入表面活性剂、助剂后即达到本发明的目标菌剂。其中，发酵液进行超滤浓缩,去掉42％水分，其特征为：：使用孔径分别为0.004um、0.001um和1nm的3个超滤膜组件，将发酵液在37℃、压力0.3mpa条件下依次同时进行连续超滤处理，超滤时间3h,得到甲基营养型芽孢杆菌lw-6液体菌剂,活孢子数≥50亿/ml.在发酵浓缩液中,加入7％的轻钙载体充分混匀，然后进行低温干燥,干燥的临界温度的范围为39℃，最高加热温度为43℃。所述剂型加工，其特征为；按照体积比加入表面活性剂十二烷基苯磺酸钠3.2％、其他助剂为3.3％膨润土、1.8％的壳聚糖，1.2％的几丁质中的一种，余量为制备的目标菌粉。

本发明的第一目的是这样实现的，所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂用于防治烟草根结线虫病以及烟草促生中的应用。

本发明所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂和以所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的制剂可应用于烟草根结线虫病的防治以及烟草促生，具有以下优点：

1、本发明所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6是一种高效生防细菌，以所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的制剂对烟草根结线虫具有显著的毒杀作用，其粉剂制剂500倍稀释液对根结线虫的生物防治率为93％。

2、本发明所述以甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的制剂的制备方法简单易行，合理有效，有利于该菌剂的工业化生产和应用普及。本发明甲基营养型芽孢杆菌lw-6的活孢子和次生代谢产物对烟草根结线虫具有显著防效及对烟草的有明显的促生作用。

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6以及甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的制剂对人畜无毒，并且具有很强的环境适应性和环境友好性，且所述甲基营养型芽孢杆菌lw-6对抗逆性强，其芽孢具有抗高温耐干旱、生长繁殖快，具有定值和竞争能力强，杀线虫效果明显。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号：cgmccno.6793。

本发明所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂，是指所述的甲基营养型芽孢杆菌lw-6经优选平板培养、特定种子培养、优选发酵、超滤浓缩、低温干燥、剂型加工制备得到的lw-6菌剂菌剂下面以具体实施案例对本发明做进一步说明：

实施例1

一种用于根结线虫生物防治的甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂的制备：

余量为水，ph为7.2～7.3。

实施例2

甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂对根结线虫的室内生物防治作用根结线虫的分离采用贝曼漏斗法进行，获得根结线虫的二龄幼虫。将分离的根结线虫添加到甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌液体制剂的500倍稀释液中，以等量的水为对照，室温放置1h观测线虫存活和死亡数量。结果表明，在对照中，根结线虫二龄幼虫的死亡率是4.41％，而甲基营养型芽孢杆菌lw-6液体制剂的500倍稀释液的处理根结线虫二龄幼虫的死亡率达到了93％，由此可见，以甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的液体制剂对根结线虫二龄幼虫具有强烈的生物防治效果。

实施例3

甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂对烟草根结线虫的田间小区防治作用烤烟品种为红花大金元，根结线虫接种方式为病土接种，烤烟移栽时每株烟施用甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂1克加水500ml灌根，以不施用制剂的清水为对照。移栽后60天挖根调查烟草根结线虫病的病情指数，在移栽期间处理组用重复处理2次,对照组用清水进行重复处理。经过甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂处理的烟草根结线虫病情指数为20.3，而没有施用该制剂的空白对照病情指数达到了69.5，由此可见，以甲基营养型芽孢杆菌lw-6为活性成分的制剂对烟草根结线虫病的生物防治效果为70.79％。

实施例4

甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂对烟草的促生作用

烤烟品种为红花大金元，促生作用以促根为主，烤烟移栽时每株烟施用甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂1克加水500ml灌根，对照为清水。移栽后60天挖根调查根长、根重以及根茎个数。试验结果见表一，表明促进根系生长效果明显。

表一甲基营养型芽孢杆菌lw-6菌剂对烟草的促生作用

(附注：表中取值为所移栽的所有株数100株测量平均值。)