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适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-05-08 10:43

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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410811213.2 (22)申请日 2014.12.22 C12Q 1/68(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 15/32(2006.01) (71)申请人中国农业科学院生物技术研究所地址 100081 北京市海淀区中关村南大街 12 号中国农业科学院生物技术研究所 (72)发明人孙国清郭三堆张锐王远王林张海鹏 (74)专利代理机构北京清亦华知识产权代理事务所 ( 普通合伙 ) 11201 代理人李志东 (54) 发明名称适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途。

2、(57) 摘要本发明公开了一种质粒标准分子，所述质粒标准分子包括Cry1A基因， CPTI基因， polyA序列， 35S 启动子序列和 NOS 终止子序列。本发明还公开了制备所述质粒标准分子的方法和包含所述质粒标准分子的试剂盒。利用本发明的质粒标准分子和/或试剂盒，能够快速、简便准确的检测转Bt 基因和 / 或 CPTI 基因的棉花。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表2页附图2页 CN 105779573 A 2016.07.20 CN 105779573 A 1/1 页 2 1.一种质粒。

3、标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子包括 Cry1A 基因， CPTI 基因， polyA 序列， 35S 启动子序列和 NOS 终止子序列。 2.权利要求1的质粒标准分子，其特征在于，所述质粒标准分子包括依次连接的35S启动子序列， Cry1A 基因， polyA 序列， NOS 终止子序列， 35S 启动子序列， CPTI 基因， NOS 终止子序列；任选的，所述质粒标准分子包含 LacZ 基因。 3.权利要求 1 或 2 的质粒标准分子在检测农作物中的 CPTI 外源基因和以下至少之一的 Bt 外源基因中的用途： Cry1Ab， Cry1Ac 和 Cry1Ab/A。

4、c。 4.权利要求 3 的用途，其特征在于，所述农作物为转 Bt 和 / 或 CPTI 基因的棉花。 5.权利要求 1 或 2 的质粒标准分子的制备方法，其特征在于，包括， (1) 获取 Bt-CpTI 基因表达质粒； (2) 酶切所述表达质粒，获得 Bt-CpTI 基因片段； (3) 将所述 Bt-CpTI 基因片段连接到克隆载体上，获得所述质粒标准分子。 6.权利要求 5 的方法，其特征在于，所述表达质粒包括依次连接的 35S 启动子序列， CryIA 基因， polyA 序列， NOS 终止子序列， 35S 启动子序列， CPTI 基因和 NOS 终止子序列。 7.权。

5、利要求 5 的方法，其特征在于，所述酶切为 EcoR1 和 HindIII 双酶切。 8.权利要求 5 的方法，其特征在于，所述克隆载体为 pEASY-T3。 9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求 1 或 2 的质粒标准分子；任选的，所述试剂盒包括 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4。 10.权利要求 9 的试剂盒在 PCR 检测转 Bt 和 / 或 CPTI 抗虫基因棉花中的用途。权利要求书 CN 105779573 A 2 1/4 页 3 适用于检测转基因抗虫棉花。

6、的质粒标准分子及其用途技术领域 0001 本发明涉及转基因植物领域，具体的，本发明涉及适用于检测转基因抗虫棉花的质粒标准分子及其用途，更具体的，本发明涉及一种质粒标准分子、质粒标准分子在检测农作物中的CPTI外源基因和Bt外源基因中的用途、质粒标准分子的制备方法、一种试剂盒以及试剂盒在 PCR 检测转 Bt 和 CPTI 双价抗虫基因棉花中的用途。背景技术 0002 棉花是我国重要的经济作物，在全球经济中起着中流砥柱作用。中国在 1997 年就已经开始有转基因植物获得安全证书，到目前为止已有 8 种植物获批，抗虫棉花是最早获批的其中之一。 0003 BT 基因。

7、即是苏云金芽胞杆菌 (Bacillus thuringiensis，简称 Bt) 基因，因其杀虫效果好、安全、高效等优点而成为应用最为广泛的杀虫微生物。美国孟山都公司把 Bt 基因插入棉花植株获得了转基因棉花植株，经与农业研究局和一些大学科学家连续两年的田间试验，防治虫害效果良好。我国 “抗虫棉” 研究在 “七五” 期间开始进行，“八五” 期间，在 “863” 计划资助下，人工合成的CryIA(b)和CryIA(c)杀虫基因导入我国棉花主栽品种获得成功，成为继美国之后，第二个拥有自主研制抗虫棉的国家。 0004 转基因产品的安全性一直备受关注，因此转基因产品的定量。

8、、定性检测尤为重要，转基因标准物质的使用是转基因产品检测结果的有效和可比的的重要保证，质粒标准分子是转基因标准物质中的一种。发明内容 0005 依据本发明的一方面，本发明提供一种质粒标准分子，所述质粒标准分子包括 CryIA 基因， CPTI 基因， polyA 序列， 35S 启动子序列和 NOS 终止子序列。所述质粒标准分子能够用于检测转基因作物中的 CryIA 外源基因和 / 或 CPTI 外源基因。在本发明的一个实施例中，所述质粒标准分子的结构示意图如图1，包括依次连接的35S启动子序列， CryIA基因， polyA 序列， NOS 终止子序列， 35S 启动。

9、子序列， CPTI 基因和 NOS 终止子序列。任选的，还包含 LacZ 基因，以在含有 IPTG， X-gal 的平板培养基上，能够进行蓝白斑筛选。本发明一方面或者任一具体实施方式中质粒标准分子，能够用于快速、简便和准确地检测转基因农作物特别是转双价抗虫基因棉花。 0006 依据本发明的另一方面，本发明提供了上述质粒标准分子在检测农作物中的 CPTI 外源基因和以下至少之一的Bt外源基因中的用途： CryIAa， CryIAb， CryIAc和CryIAab/ac。在本发明的一个实施例中，所述农作物为转 Bt 和 / 或 CPTI 抗虫基因棉花。 0007 依据本发明的。

10、再一方面，本发明提供一种上述质粒标准分子的制备方法，所述方法包括： (1) 获取 Bt-CpTI 基因表达质粒； (2) 酶切所述表达质粒，获得 Bt-CpTI 基因片段； (3)将所述Bt-CpTI基因片段连接到克隆载体上，获得所述质粒标准分子。在本发明的一个实施例中，所述表达质粒的结构示意图如图2所示，包括依次连接的35S启动子序列， CryIA 说明书 CN 105779573 A 3 2/4 页 4 基因， polyA 序列， NOS 终止子序列， 35S 启动子序列， CPTI 基因和 NOS 终止子序列。所说的 Bt-CpTI 基因片段为或者包括，依次。

11、连接的 35S 启动子序列、 CryIA 基因、 polyA 序列、 NOS 终止子序列、 35S 启动子序列、 CPTI 基因和 NOS 终止子序列。在本发明的一个实施例中，表达质粒中的 Bt-CpTI 基因片段的两端分别含有 ECOR1 和 HindIII 酶切位点，所以所述酶切为 ECOR1和HindIII双酶切。所说的克隆载体为常规的克隆载体，例如可以为pEASY-T3。利用本发明这一方面的质粒标准分子制备方法，能够简单快速的制备出所说的质粒标准分子。 0008 依据本发明的又一方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒包括本发明一方面或者上述任一具体实施方式中的质。

12、粒标准分子。在本发明的一个实施例中，所述试剂盒还包括 SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2， SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4。其中， SEQ ID NO ： 1 和 SEQ ID NO ： 2 能够与各种类型的 Bt 基因进行特异性识别，用于各种类型 Bt 基因序列的扩增， SEQ ID NO ： 3 和 SEQ ID NO ： 4 能够分别与 CPTI 基因上的不同位置特异性结合，用作特异性扩增 CPTI 基因的引物。 0009 依据本发明的一方面，本发明还提供上述试剂盒在 PCR 检测转抗虫 Bt 和 CPTI 基因棉花中的。

13、用途。上述对本发明一方面的质粒标准分子的优点和技术特征的描述，也同样适用本发明这一方面的试剂盒和 / 或试剂盒的用途，在此不再赘述。 0010 本发明的质粒标准分子和 / 或试剂盒，能够方便快捷的对转基因抗虫农作物进行检测。利用本发明的质粒标准分子的制备方法，能够快速获得所说的质粒标准分子。另外，本发明还建立一套高效的棉花基因组 DNA 提取方法，使得基因组 DNA 纯度达到 OD260/280 为 1.8-2.0，提供 2 对适用转基因农作物分子鉴定的筛选引物，特别适用棉花品种。附图说明 0011 图 1 是本发明的一个实施例中的质粒标准分子的结构示意图； 0012 。

14、图 2 是本发明的一个实施例中的 Bt-CpTI 基因表达质粒的结构示意图； 0013 图 3 是本发明的一个实施例中的 PCR 鉴定转基因棉花核酸中的外源 Bt 基因的电泳图，其中前三泳道分别为 marker、阳性对照 ( 带 Bt 基因 )、阴性对照 ( 不带 Bt 基因 )，编号 1-10 泳道分别为 10 株不同棉花转 Bt-CpTI 基因单株； 0014 图 4 是本发明的一个实施例中的 PCR 鉴定转基因棉花核酸中的外源 CpTI 基因的电泳图，其中前三泳道分别为 marker、阳性对照 ( 带 Bt 基因 )、阴性对照 ( 不带 Bt 基因 )，编号 1。

15、-10 泳道分别为 10 株不同棉花转 Bt-CpTI 基因单株。具体实施方式 0015 下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个” 的含义是两个或两个以上。除另有交待，实施例中未注明具体技术或条件的，可按照本领域内的文献所描述的技术或条件 ( 例如参考 J. 萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的分子克隆实验指南，第三版，科学出版社 ) 或者按照产品说明书进行。实施例中涉及的未特别交待的受体、酶试剂、 PCR 试剂、序列 ( 接头、标签和引物 ) 及仪器，都是常规市售产品，比如石远 321 可购自河北神农高科。

16、技股份有限公司， pEASY-T3 可购自北京全式金生物技术有限公司等。 0016 实施例一双价抗虫转基因棉花说明书 CN 105779573 A 4 3/4 页 5 0017 1. 获取 Bt-CpTI 基因表达质粒 0018 可参照郭三堆 , 崔洪志 , 抗虫棉 GFM Cry1A 杀虫基因的合成及表达载体构建 , 中国农业科技导报,2000年,第2期合成或获得抗虫基因及构建表达载体，获得Bt-CpTI 基因表达质粒 ( 以下表示为 pGBI14ABC)，图 2 展示其结构示意图， pGBI14ABC 包含 Bt 杀虫基因和修饰的豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI) 基因，且。

17、带有多个表达调控元件。 0019 2. 双价抗虫转基因棉花 0020 1) 受体棉花为石远 321，将上一步骤的 BT-CPTI 基因表达质粒通过农杆菌介导法导入到石远 321。 0021 2)PCR鉴定外源基因是否导入成功，图3和图4分别为PCR鉴定转基因棉花核酸的电泳图，分别显示在 1.8kb 和 270bp 左右有特异性条带，对应 Bt 和 CpTI 基因，表明成功获得双价抗虫基因， PCR 使用的 Bt 基因的特异性扩增引物为 0022 5 -CCTCTTCTAACTTGCCCTCCGC-3 (SEQ ID NO ： 1) 和 0023 5 -CACCCACGATGTT。

18、ACCGAGTG-3 (SEQ ID NO ： 2)，特异性扩增 CPTI 基因的引物序列为 5 -GATTTGAAGCACCTCGGAAG-3 (SEQ ID NO ： 3) 和 0024 5 -CTCATCATCTTCATCCCTGG-3 (SEQ ID NO ： 4)，这两对引物是通过多次重复验证，最终确定下来的，这两对引物可作为转抗虫 (Bt+CpTI) 基因棉花品种筛选鉴定的引物。 0025 对经过 PCR 鉴定为阳性的转基因棉花 ( 以下称为 SGK321) 进行生物性杀虫试验，结果证明其具有抗棉铃虫特性。 0026 实施例二质粒标准分子的制备 0027 以 pEASY。

19、-T3 为载体，利用 ECOR1 和 HindIII 双酶切实施例一的 Bt-CpTI 基因表达盒 ( 表达质粒 )，连接构建标准分子。 0028 1.双酶切预计获得的Bt-CpTI重组片段为4635bp，包括Bt(1.8kb)、 CpTI(275bp)，连接两个片段的酶切位点 ECOR I，和插入片段两端的酶切位点 Hind III 和 ECOR I。 0029 双酶切反应体系：无菌水 37.5L，表达质粒 5L( 浓度为 0.09ug/ul)， 10X NE Buffer25L,100X BSA 0.5L， EcoR V 1L， Hind III 1L，将上述加到 0.。

20、5ml Eppendorf 管中，混匀后，轻轻离心 10 秒， 37 度保温 1-1.5 小时，然后取出 10l, 加 2l Loading buffer( 上样缓冲液 ) 进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，电泳结果显示在大约 4600bp 处有条带，基本说明双酶切能够获得 Bt-CpTI 目的重组片段。 0030 2. 重组片段与载体连接 0031 将上述 Bt-CpTI 基因片段与棉花基因 Sadl 连接，在连接片段的两端添加 Apal、 Aatll、 Sphl、 Sall、 Ndel、 Sacl、 BstXl、 Nsil 和 M13R 酶切位点后，按照试剂盒说明书将所得片段。

21、插入pEASY-T3克隆载体，完成标准分子的构建。图1示意构建的质粒标准分子的结构。 0032 3. 检测所构建的质粒标准分子 0033 根据插入片段 ( 含两端酶切位点 ) 设计引物，进行 PCR 扩增，将扩增结果进行测序，并对测序结果与设计序列进行匹配比对，结果完全吻合，经测序及 PCR 扩增，获得与预期片断大小及序列一致的目的基因片段 , 证明所构建的质粒标准分子是正确的，可以用来作为不同品种转基因农作物定性检测 Cry1A 基因和 CpTI 基因的通用阳性标准分子。 0034 实施例三质粒标准分子在检测转基因抗虫棉花中的应用 0035 1. 提取转基因棉花基因组。

22、 DNA 说明书 CN 105779573 A 5 4/4 页 6 0036 1) 取 SGK321 的种子，去壳备用。 0037 2) 试验时，取材料约 2g，立即放入冰冻过的研钵中，迅速在种子上均匀撤上约 50mg 的 DIECA 晶体，加入液氮后，快速研磨成粉末状。 0038 3) 快速装入 50ml 的离心管，加入 60的水中预热过的提取液 12ml(0.1mol/L Tris-HC1pH8.0， 0.02mol/L EDTA pH8.0， 1.5mol/L NaC1， 2 PvP40w/v)， 2 CTAB(w/v)，临用前加 2的 - 巯基乙醇 )，加约 50。

23、mg 活性炭，混匀， 60水浴 40min。 0039 4)取出离心管，加入等体积的氯仿:异戊醇(24:1， v/v)，盖上盖子后，缓慢上下颠倒离心管 30 50 次。之后，平衡离心管， 8000rpm 离心 10min。 0040 5) 取上清于 50ml 离心管中，加等体积的氯仿 : 异戊醇 (24:1， v/v)，重提 2 次。 0041 6) 重取上清，加 0.6 倍体积的冰冷异丙醇，缓慢颠倒离心管，直至有絮状沉淀集结。静止 30min 后， 8000rpm 离心 5min 0042 7) 倾去上清，用 70的酒精洗 2 3 次， 100的酒精洗 1 次，将。

24、沉淀转到 8ml 离心管中，风干。 0043 8) 加 2mlTE(10mmol/L Tris-HCI， 1mmolL EDTA， pH8.0)， 65的水浴中溶解 20min 或过夜。 0044 9) 加 20ul 无 DNA 酶的 RNA 酶 A(10g/L)， 37保温 1h。 0045 10) 加等体积的氯仿 : 异戊醇 (24:1， v/v)，缓慢颠倒离心管 30 50 次，平衡离心管， 8000rpm 离心 10min。 0046 11) 取上清，加 0.1 倍体积的 3mol/L NaAc(pH5.2)，混匀后，缓慢加入 2 倍体积的冰冷的无水乙醇，静止 5m。

25、in 后，缓缓水平转离心管 5min，此时，将于界面处形成一团粘稠的透明的含有许多气泡的絮状沉淀，将此沉淀轻轻钩出，转到 1.5ml 的 eppendoff 管中。 0047 12)加l ml 70的酒精， 12000rpm离心10min，倾去酒精，再用70、 100的酒精洗一次，风干。 0048 13) 溶于 200 500ul 的 TE 中，于 -20或 -70的冰箱中保存备用。 0049 2. 质粒标准分子 DNA 提取 0050 可参照已有技术进行。 0051 3. 转基因棉花和质粒标准分子 DNA 检测 0052 电泳检测，根据条带的亮度和扩散程度判断 DNA。

26、质量，利用紫外分光光度法测定所提 DNA 的浓度和纯度。棉花富含棉酚、多糖、单宁等其它干扰物质，在细胞破碎时，棉酚等多酚类物质自动氧化，然后跟蛋白质、核酸等发生不可逆反应，结果形成棕色胶状复合物，从而难以获得高质量的DNA。棉籽仁中含有大约87的蛋白、脂肪和糖类，剩下不足13的水分、灰分、纤维素和其它。从中能够提出高质量、高效率的 DNA 是非常困难的。发明人总结了前人提取种子基因组 DNA 的经验，提出如上述一套高效提取棉花种子基因组 DNA 的方法，使得提取的基因组 DNA 纯度达到 OD260/280为 1.8-2.0。 0053 4. 待测。

27、转基因棉花 PCR 反应 0054 PCR 引物可利用前面序列，取 PCR 产物进行电泳，根据电泳结果是否出现特异性条带，判断该待测转基因棉花是否含有相应的 Bt 和 CpTI 外源基因。Bt 和 CpTI 外源基因可一起测也可分别测。说明书 CN 105779573 A 6 1/2 页 7 0001 0002 序列表 CN 105779573 A 7 2/2 页 8 序列表 CN 105779573 A 8 1/2 页 9 图 1 图 2 说明书附图 CN 105779573 A 9 2/2 页 10 图 3 图 4 说明书附图 CN 105779573 A 10 。