转新型抗虫基因Vip3A 棉花的获得及抗虫性鉴定

肖娟丽，罗晓丽，王志安，张安红

（山西省农业科学院棉花研究所，山西运城044000）

棉花作为一种自然纤维、植物蛋白和食用油的重要来源，具有非常重要的社会价值和经济价值。棉花虫害是导致棉花产量和品质下降的主要因素，给棉农造成重大的经济损失。转Bt Cry1Ab/c 基因抗虫棉的推广应用很好的控制了害虫的危害，取得了巨大的生态和经济效益[1]。随着单一杀虫基因抗虫棉种植面积的扩大和种植时间的延长，棉铃虫对Cry1Ab/c 抗虫基因产生抗性的风险也逐渐增加[2]。因此，通过发掘不同杀虫机理的Bt 杀虫基因，创制含有不同杀虫机理抗虫棉花新材料，可以缓解害虫对单一转基因抗虫棉产生的抗性，并延长转Cry1Ab/c 基因抗虫棉的使用寿命，是解决这一问题较为经济、安全的有效措施[3-4]。

Vip3A 类杀虫蛋白是在苏云金芽孢杆菌（Bt）营养生长期所产生的蛋白，它不形成晶体，不同于Bt芽孢形成期产生的晶体毒蛋白。它与Cry 类杀虫晶体蛋白的氨基酸序列同源性极低，是一类广谱杀虫蛋白。Vip3A 杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目及同翅目等多种害虫具有极高的杀虫活性，为一类新型的杀虫蛋白[5]。

本研究通过农杆菌介导获得转基因抗虫棉Vip3A 材料，对这些材料进行目的基因PCR 分子检测、蛋白酶联免疫检测和室内抗虫性检测等，分析目的基因Vip3A 转入棉花受体中的表达情况和抗虫性，为棉花抗虫育种提供新的材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验所用转基因受体材料为冀合713，由山西省农业科学院棉花研究所生物技术研究室提供。所用的表达载体用植物第一密码子改造的苏云金芽孢杆菌营养期杀虫蛋白Vip3A，人工合成改造后的Vip3A 和叶绿体、线粒体信号肽（TS）序列并进行融合，构建了植物表达载体pBTVip（图1），由中国科学院微生物研究所提供。

1.2 转基因棉花的卡那霉素筛选和PCR 分子检测

1.2.1 转基因棉花的卡那霉素筛选 本试验所用的转化受体为冀合713，利用农杆菌介导法[6]进行棉花的遗传转化。转基因棉花植株通过嫁接成活后，待叶片长出2 片真叶时，对顶部幼嫩叶片中部涂抹1 600 mg/L 医用卡那霉素，5d 后观察叶片的反应情况[7]。

1.2.2 转基因棉花的PCR 分子检测 对卡那霉素抗性转Vip3A 基因材料及对照叶片进行DNA 提取，以转化受体冀合713 为阴性对照，以含有目的片段的质粒为阳性对照，进行PCR 扩增。

参考CTAB 法提取棉花总的DNA[8]，设计Vip3A基因检测引物P1：5′-CTCCACTGACGTAAGGGAT GACGC-3′；P2：5′-ATCATCGCAAGACCGGCAACA GG-3′，预计这对引物应扩增出506 bp 左右的片段。PCR 反应体系为25 μL，体系中各个反应底物按标准PCR 要求，终浓度分别是：1 PCR buffer（含Mg2+），0.075 mmol/L dNTP，1 μmol/L primer，20 ng 棉花总DNA，1 U Taq 酶/管。PCR 扩增条件是：95 ℃预变性3 min；94 ℃变性50 s，58 ℃退火50 s，72 ℃延伸50 s，32 个循环；最后72 ℃延伸5 min，反应完后4 ℃保存待用。

1.3 转基因棉花蛋白表达检测

结合PCR 检测和农艺性状调查，对获得的转基因植株进行ELISA 鉴定。在苗期、蕾期、初花期、盛花期、铃期、吐絮期取棉花顶部幼嫩叶片进行蛋白表达检测。初花期选择根、茎、叶、花进行蛋白表达检测，收获后选取完全成熟的种子进行蛋白表达检测。取棉花组织50 mg 左右，用液氮研磨后加入提取缓冲液（1 mmol/L PMSF，0.1%（m/V）NaCl，1 mol/L Leupeptin，0.05%（V/V）Tween-20，50 mmol/LNa2CO3，pH 值9.5，0.05%（V/V）巯基乙醇），混匀后10 000 r/min 离心10 min。取上清液用于蛋白检测。采取双抗夹心法，用包被液（50 mmol/L Na2CO3，0.02%（m/V）NaN3）包被一抗，一抗为鸡抗B.t.血清（1∶2 500），二抗用鼠抗B.t.血清（1∶1 000），酶联抗体用羊抗鼠的碱性磷酸酯酶标记的IgG，抗体稀释用磷酸缓冲液PBST（40 g/L NaCl，4.4 g/L KH2PO4，29.1 g/L Na2HPO4·12H2O，0.5 mL/LTween-20，pH 值7.2～7.4），用1 mg/mL 对硝基苯磷酸二钠显色15～30 min，405 nm 测紫外线吸收值。用Bio-Rad protein assay kit 测定蛋白浓度，对照用转基因受体棉花的叶片，用大肠原核诱导的Vip3A 蛋白作标准曲线，计算Vip3A 蛋白的表达量[9]。

1.4 转基因棉花室内抗虫试验

温室内嫁接成活的转基因棉花开花时，取棉株顶部倒二幼嫩叶片，放入有湿润滤纸的试管内，每管接3 条2 日龄棉铃虫，用棉塞封口，在25～28 ℃条件下培养[10]。4 d 以后参照文献[11]检测叶片的取食情况和虫的死亡情况及大小。

2 结果与分析

2.1 转基因棉花的获得和选育

以冀合713 为转化受体，利用农杆菌介导法进行棉花遗传转化，共获得32 株T0 转基因再生植株。卡那霉素筛选表明，25 个再生植株叶片涂抹部位没有出现颜色变化，为卡那霉素阴性植株；有7 株棉花叶片涂抹部位呈现黄色，为卡那霉素阳性植株。

在检测的25 株转基因植株中，有22 个转基因样品扩增出506 bp 特异性条带，且与阳性对照质粒条带大小相同，而阴性对照没有扩增出目的条带，因此，表明目的基因已经转入棉花中（图2）。

2.2 转基因棉花植株的Vip3A 蛋白表达分析

通过总蛋白的ELISA 检测，3 个转基因棉花株系Vip3A蛋白的表达都是叶中表达量最高，其次为根和茎，在花和种子中的表达最低，但是3 个株系的同一组织之间的表达差异显着（图3）。

3 个转基因棉花株系Vip3A蛋白的表达都是在苗期的表达量最高，蕾期、初花期、盛花期、铃期不断下降，吐絮期表达最低（图4）。

2.3 转基因棉花的抗虫性分析

从图5 可以看出，非转基因对照植株叶片被大面积取食，而3 个转基因植株BV01、BV02、BV03 叶片上只有一些被食孔，但不多；转基因3 个植株BV01、BV02、BV03 叶片对2 代棉铃虫抗性的校正死亡率分别为85.7%、83.2%、86.6%，与正对照晋棉50（转Cry1Ac 基因棉花品种）相比，无显着差异，3 个转Vip3A 基因植株对棉铃虫幼虫都具有较高的抗性。

3 结论与讨论

转基因抗虫棉自1997 年商业化种植以来，有效地控制了棉铃虫的种群，增加了有益天敌的数量，减少了农药的使用，取得了显着的效益。虽然转基因棉花的推广应用有效的控制了棉铃虫的危害，但是我国转基因抗虫棉抗性基因型单一、品种繁多、抗虫性参差不齐，随着种植时间的延长转基因抗虫棉有可能对棉铃虫产生抗性[12-14]。山西省农业科学院棉花研究所生物技术室转基因课题组通过对转Vip3A 基因棉花的3 个植株分析，发现其对棉铃虫有较高抗性，可为棉花抗虫育种提供一个新型的抗性基因。

鉴于其与商业上推广的转基因抗虫棉所表达的杀虫晶体蛋白没有交互抗性，对哺乳动物没有危害，国内关于转Vip3A 基因抗虫棉未见报道，因此培育和推广新的转基因抗虫棉具有极大的应用价值[15-17]。目前，本课题组已对该基因进行了安全评价相关试验，正申报该基因在山西省的环境释放[18]。下一步将继续进行转基因株系的自交扩繁及严格的筛选鉴定，为抗虫棉花新品种的研发和大面积种植提供材料。

本文由 @ 修订发布于 2024-12-05 13:49:21

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