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黄瘤孢霉孢子粉的制备方法.pdf

来源：花匠小妙招时间：2025-05-01 15:01

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1、(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202011047988.9 (22)申请日 2020.09.29 (83)生物保藏信息 CGMCC No.20259 2020.09.11 (71)申请人辽宁省微生物科学研究院地址 122000 辽宁省朝阳市双塔区龙山街四段820号 (72)发明人钟丽娟赵新海张庆华关艳丽池景良陈飞韩冰桓明辉王志王艳华李赞 (74)专利代理机构沈阳亚泰专利商标代理有限公司 21107 代理人马维骏 (51)Int.Cl. C12N 1/14(2006.01) C12N 1/02。

2、(2006.01) C12N 13/00(2006.01) C12N 3/00(2006.01) A61K 36/06(2006.01) A61P 7/04(2006.01) C12R 1/645(2006.01) (54)发明名称一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法 (57)摘要本发明属于生物工程技术领域，涉及一种真菌中药原料的制备方法，尤其涉及一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法。所述的黄瘤孢霉孢子粉产自黄瘤孢霉HLB01，保藏编号为CGMCC 20259。所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，包括菌种选育、种子制作、液体菌种制作、菌种产孢培养和孢子粉收集与制备。本发明利用紫外。

3、诱变方法进行菌株分离与选育获得黄瘤孢霉菌种，具有抗逆性更强，菌丝生长快，产孢能力强，产孢量可达 21.15mg/cm2，为黄瘤孢霉孢子粉产品制备奠定良好的技术基础。本发明提供的黄瘤孢霉孢子粉的制备方法为拓展药用真菌的开发利用提供了新资源，解决了黄瘤孢霉孢子粉规模化制备问题，为其后续开发利用提供技术基础；并且提供了黄瘤孢霉菌种配方和产孢培养技术，可以根据自身生产条件灵活缩短生产周期。权利要求书2页说明书7页序列表1页附图1页 CN 112143656 A 2020.12.29 CN 112143656 A 1.一种黄瘤孢霉菌种，其特征在于，。

4、所述黄瘤孢霉为黄瘤孢霉HLB01，该菌株于2020年9 月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC 20259。 2.一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：步骤一、菌种选育 (1)菌种分离：野外采集感染黄瘤孢霉的牛肝菌子实体，放置于30W紫外灯下，照射距离 30cm，照射5min，将子实体表层孢子粉挑取一环，放入装有10mL无菌水的试管中，振荡均匀，用移液器将孢子液吸取100L至综合PDA培养基上，刮铲涂抹均匀， 30培养4-7d，挑。

5、取产生金黄色孢子的目的菌落边缘，纯化2-3次后，保藏备用； (2)菌种诱变：在无菌条件下，向斜面试管菌种中缓慢加入10mL无菌水，轻轻振动后，将孢子悬液倒入无菌平皿中，浓度约为1107cfu/mL，放置于30W紫外灯下，照射距离30cm，照射120s；在无菌条件下，将经紫外照射的孢子悬液经适当稀释后分别吸取100L至综合PDA 平板中，涂抹均匀， 30培养7d，挑取孢子产量最大的菌落边缘，纯化2次后，转接至PDA斜面试管培养至满管，保藏备用；并连续传代5次，考察菌株产孢量；步骤二、种子制作在无菌条件下将黄瘤孢霉菌种接种至母种茄瓶培养基，母种。

6、培养基为综合PDA加富培养基，置于30恒温培养箱中培养7天，待茄瓶斜面长满即得种子；步骤三、液体菌种制作待灭菌后的液体培养基温度降至30以下进行接种，将茄瓶斜面种子用接种铲划成约 0.5cm0.5cm大小的接种块，于无菌条件下转接5-6块至150mL液体菌种培养基中， 30， 170rpm/min，培养5天，菌球比例达到体积比80%以上，即得液体原种；步骤四、菌种产孢培养 (1)配料与灭菌：将培养基配方A或培养基配方B配制培养基，分装灭菌，培养基配方A 需装入耐高温高压玻璃容器中，装量为容器容积的50%， 121灭菌30分钟；培养基配方B可装入尺寸为35c。

7、m17cm的食用菌生产用聚丙烯塑料袋，装量为200g左右， 121灭菌45分钟；同时将接种枪灭菌备用； (2)接种与培养：将灭菌培养基取出，培养基配方A需接上灭菌的接种枪设备，将培养基接入已灭菌的玻璃或塑料容器中，无菌塑料膜封口，待琼脂凝固后，用另一把接种枪向容器内加入20mL液体菌种，摇晃均匀；培养基配方B需放凉至30左右，在无菌条件下直接向培养料内加入10mL液体菌种，混合均匀后，平铺成约1.5cm厚度；接种后，放置于30培养箱或培养室内进行培养管理；步骤五、孢子粉收集与制备培养基配方A是琼脂板培养基，黄色孢子分布于培养基表层，使用刮铲平刮。

8、收集后45 烘干即得黄瘤孢霉孢子粉；培养基配方B为松散的固体培养料，黄色孢子分布于物料颗粒表层，需将物料取出后， 45烘干后过60目标准筛，收集筛下物即为黄瘤孢霉孢子粉；获得的黄瘤孢霉孢子粉分装至塑料包装袋后，真空包装保存。 3.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，其特征在于，步骤一中所述综合PDA 培养基的原料组成为每升培养基含有200克土豆汁，硫酸镁1.5克，磷酸二氢钾3克，葡萄糖 20克，琼脂20克，其余为水，培养基灭菌条件为121， 30分钟。权利要求书 1/2 页 2 CN 112143656 A 2 4.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法。

9、，其特征在于，步骤二中所述改良综合 PDA培养基的原料组成为：每升培养基含有200克土豆汁，蛋白胨2.5克，葡萄糖15克，磷酸二氢钾3.6克，硫酸镁1.4克，牛肝菌干粉2.0克，琼脂20克，其余为水，培养基灭菌条件为121 ， 30分钟。 5.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，其特征在于，步骤三中液体菌种培养基配方组成以重量百分比计为：土豆汁20%，红糖0.3%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾1.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.1%，氯化铵0.5%，其余为水；培养基灭菌条件为21， 30分钟。 6.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方。

10、法，其特征在于，步骤四中所述培养基配方A 组成以重量百分比计为：土豆汁20%，红糖0.3%，葡萄糖0.5%，磷酸氢二钾1.5%，磷酸二氢钾0.5%，硫酸镁0.1%，氯化铵0.5%，琼脂2%，其余为水。 7.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，其特征在于，步骤四中所述培养基配方B 组成以重量百分比计为：麸皮75.0%，稻壳15.0%，葡萄糖0.5%，红糖0.2%，蛋白胨1.0%，牛肝菌干粉0.2%，磷酸氢二钾0.5%，磷酸二氢钾0.3%，硫酸镁0.1%，氯化铵0.5%，料水比1:1。 8.如权利要求2所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，其特。

11、征在于，步骤四中所述培养管理包括控制培养温度在2530之间，空气相对湿度无特殊要求，初期生长出白色菌丝，培养至3-5天可见黄色粉状孢子产生，培养至7-10天产生大量黄色粉状孢子，可以收集孢子。 9.由权利要求2-8所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法制得黄瘤孢霉孢子粉纯度高于99%。 10.由权利要求2-8所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法制得黄瘤孢霉孢子粉在制备用于外伤止血药物中的应用。权利要求书 2/2 页 3 CN 112143656 A 3 一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法技术领域 0001 本发明属于生物工程技术领域，涉及一种真菌中药原料的制备方法，尤其涉及一种黄瘤孢霉孢子。

12、粉的制备方法。背景技术 0002 黄瘤孢霉常寄生于野外的牛肝菌、伞菌的子实体上，产生大量金黄色孢子。在中药上，将该菌称为黄麻球孢霉，其有性世代为金孢菌寄生菌Hypomyces chrysospermus，中华本草上记载黄麻球孢霉的孢子粉性温，微苦，归经肺经，可以适量外敷，主治外伤出血，同马勃孢子功能相似，是止血良药。但是野外收集孢子粉难度大，实际应用进展缓慢，国内关于黄瘤孢霉的报道较少，万方数据库上仅检索到2篇，均为资源介绍。国外对该菌报道也不多，主要集中于从该菌中提取黄孢拉定(chrysodin)和黄瘤孢素(sepedonin)等类抗菌肽功。

13、能物质研究方面，国内外尚未对该菌进行有效开发利用。随着生物技术的发展，真菌药物的开发利用会越来越被重视，与马勃相比，黄瘤孢霉的孢子粉作为中药原料制备有较为明显的优势，无需经历有性世代，其孢子粉制备周期明显缩短，此外，黄瘤孢霉孢子中还含有黄瘤孢定(chrysodin)、黄瘤孢素(sepedonin)等新型抗菌素类物质，开发利用前景广阔。因此，研究开发一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法是亟需解决的问题。发明内容 0003 鉴于现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法。所述的黄瘤孢霉孢子粉产自黄瘤孢霉HLB-01，保藏编号为CGMCC。

14、 No.20259。所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，包括黄菌种选育、种子制作、液体菌种制作、菌种产孢培养和孢子粉收集与制备。本发明利用紫外诱变方法进行菌株分离与选育获得黄瘤孢霉菌种，抗逆性更强，菌丝生长快，产孢能力强，产孢量可达21.15mg/cm2，为黄瘤孢霉孢子粉产品的制备奠定了良好的技术基础。本发明提供的黄瘤孢霉孢子粉的制备方法为拓展药用真菌的开发利用提供了新资源，解决了黄瘤孢霉孢子粉规模化制备问题，为其后续开发利用提供技术基础。 0004 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案。 0005 一种黄瘤孢霉菌种，所述黄瘤孢霉为金孢菌寄生菌(Hypom。

15、yces chrysospermus)，该菌株于2020年9月11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 20259。 0006 所述黄瘤孢霉菌种的选育方法，具体包括以下步骤。 0007 步骤1、菌种分离：野外采集感染黄瘤孢霉的牛肝菌子实体，放置于30W紫外灯下，照射距离30cm，照射5min，将子实体表层孢子粉挑取一环，放入装有10mL无菌水的试管中，振荡均匀，用移液器将孢子液吸取100 L至综合PDA培养基上，刮铲涂抹均匀， 30培养4- 7d，挑取。

16、产生金黄色孢子的目的菌落边缘，纯化2-3次后，保藏备用。 0008 步骤2、菌种诱变：在无菌条件下，向斜面试管菌种中缓慢加入10mL无菌水，轻轻振说明书 1/7 页 4 CN 112143656 A 4 动后，将孢子悬液倒入无菌平皿中，浓度约为1107cfu/mL，放置于30W紫外灯下，照射距离 30cm，照射120s；在无菌条件下，将经紫外照射的孢子悬液经适当稀释后分别吸取 100 L至综合PDA平板中，涂抹均匀， 30培养7d，挑取孢子产量最大的菌落边缘，纯化 2次后，转接至PDA斜面试管培养至满管，保藏备用；并连续传代5次，考察菌株产孢量。。

17、0009 一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，包括菌种选育、种子制作、液体菌种制作、菌种产孢培养和孢子粉收集与制备。 0010 所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法，具体包括以下步骤。 0011 步骤一、菌种选育。 0012 (1)菌种分离：野外采集感染黄瘤孢霉的牛肝菌子实体，放置于30W紫外灯下，照射距离30cm，照射5min，将子实体表层孢子粉挑取一环，放入装有10mL无菌水的试管中，振荡均匀，用移液器将孢子液吸取100 L至综合PDA培养基上，刮铲涂抹均匀， 30培养 4-7d，挑取产生金黄色孢子的目的菌落边缘，纯化2-3次后，保藏备用。 0013 (2)菌。

18、种诱变：在无菌条件下，向斜面试管菌种中缓慢加入10mL无菌水，轻轻振动后，将孢子悬液倒入无菌平皿中，浓度约为1107cfu/mL，放置于30W紫外灯下，照射距离 30cm，照射120s；在无菌条件下，将经紫外照射的孢子悬液经适当稀释后分别吸取 100 L至综合PDA平板中，涂抹均匀， 30培养7d，挑取孢子产量最大的菌落边缘，纯化 2次后，转接至PDA斜面试管培养至满管，保藏备用；并连续传代5次，考察菌株产孢量。 0014 步骤二、种子制作。 0015 在无菌条件下将黄瘤孢霉菌种接种至母种茄瓶培养基，母种培养基为综合PDA加富培养基，置于30恒温。

19、培养箱中培养7天，待茄瓶斜面长满即得种子。 0016 步骤三、液体菌种制作。 0017 待灭菌后的液体培养基温度降至30以下进行接种，将茄瓶斜面种子用接种铲划成约0.5cm0.5cm大小的接种块，于无菌条件下转接5-6块至150mL液体菌种培养基中， 30 ， 170rpm/min，培养5天，菌球比例达到体积比80以上，即得液体原种。 0018 步骤四、菌种产孢培养。 0019 (1)配料与灭菌：将培养基配方A或培养基配方B配制培养基，分装灭菌，培养基配方A需装入耐高温高压玻璃容器中，装量为容器容积的50， 121灭菌30分钟；培养基配方 B可装入尺寸为35cm1。

20、7cm的食用菌生产用聚丙烯塑料袋，装量为200g左右， 121灭菌45 分钟；同时将接种枪灭菌备用。 0020 (2)接种与培养：将灭菌培养基取出，培养基配方A需接上灭菌的接种枪设备，将培养基接入已灭菌的玻璃或塑料容器中，无菌塑料膜封口，待琼脂凝固后，用另一把接种枪向容器内加入20mL液体菌种，摇晃均匀；培养基配方B需放凉至30左右，在无菌条件下直接向培养料内加入10mL液体菌种，混合均匀后，平铺成约1.5cm厚度；接种后，放置于 30培养箱或培养室内进行培养管理。 0021 步骤五、孢子粉收集与制备。 0022 培养基配方A是琼脂板培养基，黄色孢子分。

21、布于培养基表层，使用刮铲平刮收集后 45烘干即得黄瘤孢霉孢子粉，产孢量为20.15mg/cm2；培养基配方B为松散的固体培养料，黄色孢子分布于物料颗粒表层，需将物料取出后， 45烘干后过60目标准筛，收集筛下物即为黄瘤孢霉孢子粉，产孢量为23.20mg/g干料。获得的黄瘤孢霉孢子粉分装至塑料包装袋说明书 2/7 页 5 CN 112143656 A 5 后，真空包装保存。 0023 进一步地，步骤一中所述综合PDA培养基的原料组成为每升培养基含有200克土豆汁，硫酸镁1.5克，磷酸二氢钾3克，葡萄糖20克，琼脂20克，其余为水，培养基灭菌条件为121 ，。

22、30分钟。 0024 进一步地，步骤二中所述改良综合PDA培养基的原料组成为：每升培养基含有200 克土豆汁，蛋白胨2.5克，葡萄糖15克，磷酸二氢钾3.6克，硫酸镁1.4克，牛肝菌干粉2.0克，琼脂20克，其余为水，培养基灭菌条件为121， 30分钟。 0025 进一步地，步骤三中液体菌种培养基配方组成以重量百分比计为：土豆汁20，红糖0.3，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，其余为水；培养基灭菌条件为21， 30分钟。 0026 进一步地，步骤四中所述培养基配方A组成以重量百分比计为：土豆汁20，红。

23、糖 0.3，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，琼脂2，其余为水。 0027 进一步地，步骤四中所述培养基配方B组成以重量百分比计为：麸皮75.0，稻壳 15.0，葡萄糖0.5，红糖0.2，蛋白胨1.0，牛肝菌干粉0.2，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.3，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，料水比1:1。 0028 进一步，步骤四中所述培养管理包括控制培养温度在2530之间，空气相对湿度无特殊要求，初期生长出白色菌丝，培养至3-5天可见黄色粉状孢子产生，培养至7-10天产生大量黄色粉状孢子，可以收集孢。

24、子。 0029 所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法制得黄瘤孢霉孢子粉纯度高于99。 0030 所述黄瘤孢霉孢子粉的制备方法制得黄瘤孢霉孢子粉在制备用于外伤止血药物中的应用。 0031 与现有技术比，本发明具有以下有益效果。 0032 1)本发明利用紫外诱变方法进行菌株分离与选育获得黄瘤孢霉菌种，抗逆性更强，菌丝生长快，产孢能力强，产孢量可达21.15mg/cm2，为黄瘤孢霉孢子粉产品的制备奠定了良好的技术基础。 0033 2)本发明提供的黄瘤孢霉孢子粉的制备方法为拓展药用真菌的开发利用提供了新资源，解决了黄瘤孢霉孢子粉规模化制备问题，为其后续开发利用提供技术基础。 0034 。

25、3)本发明的黄瘤孢霉孢子粉的制备方法提供了黄瘤孢霉菌种配方和产孢培养技术，可以根据自身生产条件灵活缩短生产周期。附图说明 0035 图1是实施例1黄瘤孢霉rDNA-ITS序列。具体实施方式 0036 以下结合附图和具体实施例对本发明进行进一步说明。 0037 实施例1金孢菌寄生菌Hypomyces chrysospermus的分离鉴定及其生物学特性研究。 0038 2012年在开展辽西大型真菌资源调查研究中，分离到一株牛肝菌致病菌，该菌菌说明书 3/7 页 6 CN 112143656 A 6 丝在牛肝菌子实体上平伏生长，侵染初期为白色，此时主要为菌丝阶段；侵染后期子实体。

26、逐渐腐烂而产生大量黄色粉末，此时为产孢阶段。采用稀释法进行了菌种分离，并采用紫外诱变法进行了高产孢菌株选育。 0039 一、培养基。 0040 综合PDA培养基：按质量百分比计为每升培养基含有200克土豆汁，硫酸镁1.5 克，磷酸二氢钾3克，葡萄糖20克，琼脂20克，其余为水，分装三角瓶后，将其中7瓶分别用40 NaOH和0.1mol/LHCl调节培养基pH至4.5、 5.5、 6.5、 7.5、 8.5、 9.5、 10.5， 121灭菌30分钟。 0041 装有10mL无菌水试管10支，备用。 0042 二、菌株分离与鉴定。 0043 (1)菌种分离：野外。

27、采集感染黄瘤孢霉的牛肝菌子实体，放置于30W紫外灯下，照射距离30cm，照射5min，将子实体表层孢子粉挑取一环，放入装有10mL无菌水的试管中，振荡均匀，用移液器将孢子液吸取100 L至综合PDA培养基上，刮铲涂抹均匀， 30培养4-7d，挑取产生金黄色孢子的目的菌落边缘，纯化2-3次后，保藏备用。 0044 (2)菌种诱变：在无菌条件下，向斜面试管菌种中缓慢加入10mL无菌水，轻轻振动后，将孢子悬液倒入无菌平皿中(浓度约为1107cfu/g)，放置于30W紫外灯下，照射距离 30cm，照射120s。在无菌条件下，将经紫外照射的孢子悬液分别吸取。

28、100 L至综合PDA 平板中，涂抹均匀， 30培养7d，挑取孢子产量最大的菌落边缘，纯化2次后，转接至 PDA斜面试管培养至满管，保藏备用。另将斜面菌种寄送上海生工进行ITS序列分析。 0045 该菌菌落形态初期白色，边缘整齐，在PDA上培养4-5天开始产生黄色孢子，后期菌落表层布满黄色孢子；其显微形态特征为菌丝有隔膜，分枝发达、匍匐生长，近无色。分生孢子梗短，多分枝。分生孢子顶生于孢梗顶端，分生孢子圆柱状或椭圆形， 3.1-5.44.5- 7.3 m；厚垣孢子单生，顶生于菌丝侧枝，球形，表层有瘤状突起，初时无色，后呈黄色至金黄色，数量。

29、极多，直径12.2-18.5 m。依据真菌形态学鉴定特征并结合rDNA-ITS序列 (图1所示)分析结果，鉴定该菌为金孢菌寄生菌(Hypomyces chrysospermus)，其有性世代为金孢菌寄生菌(Hypomyces chrysospermus Tul.&C.Tul.)。 0046 三、菌株生物学特性研究。 0047 对该菌生物学特性展开研究，试验结果表明，黄瘤孢霉最适生长温度为25-30 ，最适pH为6.5，在PDA培养基上，培养96h，菌落直径可达69.18mm，产生大量黄色孢子。高于35，该菌生长受限， 40时不生长，但恢复至30以下培养温度，。

30、可恢复生长，见表1-2。 0048 表1.不同培养温度对黄瘤孢霉生长的影。 0049 注：“-” 表示未生长；“+” 表示少量产孢，“+” 表示产孢量较大。 0050 表2.不同pH黄瘤孢霉生长的影响。说明书 4/7 页 7 CN 112143656 A 7 0051 注：“-” 表示未生长；“+” 表示少量产孢，“+” 表示产孢量中等，“+” 表示产孢量较大。 0052 实施例2不同菌种类型对产孢的影响。 0053 一、培养基。 0054 改良综合PDA培养基的原料组成按质量百分比计为：每升培养基含有200克土豆汁，蛋白胨2.5克，葡萄糖15克，磷酸二氢钾3.6克，硫酸。

31、镁1.4克，牛肝菌干粉2.0克，琼脂20 克，其余为水，培养基制备好后，分装入茄瓶，每瓶70mL。 0055 液体菌种培养基配方：以重量百分比计为，土豆汁20，红糖0.3，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.1，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，其余为水，每瓶50mL。 0056 产孢培养基配方A：土豆汁20，红糖0.3，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，琼脂2，其余为水。 0057 培养基灭菌条件： 121， 30分钟。 0058 二、种子制作。 0059 (1)茄瓶种子制备方法：在无菌条。

32、件下将黄瘤孢霉菌种接种至母种茄瓶培养基，置于 30恒温培养箱中培养7天，待茄瓶斜面长满即得种子；液体菌种制备方法：待灭菌后的液体培养基温度降至30以下进行接种，将茄瓶斜面种子用接种铲划成约0.5cm0.5cm大小的接种块，于无菌条件下转接5-6块至150mL液体菌种培养基中， 30， 170rpm/min，培养5 天，菌球比例达到体积比80以上，即得液体原种。 0060 三、产孢培养。 0061 将产孢培养基倒入直径为90mm的灭菌平皿中，待平板放凉备用。将茄瓶菌种中加入100mL无菌水，用接种针轻轻将表层孢子刮下，制备成孢子悬液，浓度为1 106cfu/。

33、mL，再依次稀释至1102cfu/mL。另将液体菌种中加入100mL无菌水稀释，二次稀释至1102个菌球/mL。每皿加入0.1mL菌悬液或0.1mL液体菌种稀释液，用刮铲涂抹均匀。接种后，放置于 30培养箱恒温培养。试验结果表明，液体菌种明显优于孢子悬浮液，萌发快，生长迅速，产孢量大，能明显降低，见表3。 0062 表3.不同菌种对黄瘤孢霉生长及产孢的影响。 0063 注：“-” 表示未生长；“+” 表示少量产孢，“+” 表示产孢量中等，“+” 表示产孢量较大。 0064 实施例3不同培养方式及培养基对产孢的影响。 0065 一、培养基制作。 0066 (1。

34、)母种培养基组成：每升培养基含有200克土豆汁，蛋白胨2.5克，葡萄糖15克，磷说明书 5/7 页 8 CN 112143656 A 8 酸二氢钾3.6克，硫酸镁1.4克，牛肝菌干粉2.0克，琼脂20克，其余为水。培养基灭菌条件： 121， 30分钟。 0067 (2)液体菌种培养基配方：以重量百分比计为，土豆汁20，红糖0.3，葡萄糖 0.5，磷酸氢二钾1.5，磷酸二氢钾0.5，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，其余为水；培养基灭菌条件： 121， 30分钟。 0068 产孢培养基配方A：土豆汁20，红糖0.3，葡萄糖0.5，磷酸氢二钾1.5，磷。

35、酸二氢钾0.5，硫酸镁0.1，氯化铵0.5，琼脂2，其余为水。装入耐高温高压玻璃容器中，装量为容器容积的50， 121灭菌30分钟。 0069 产孢培养基配方B：麸皮75.0，稻壳15.0，葡萄糖0.5，红糖0.2，蛋白胨 1.0，牛肝菌干粉0.2，磷酸氢二钾0.5，磷酸二氢钾0.3，硫酸镁0.1，氯化铵 0.5，料水比1： 1。装入尺寸为35cm17cm的食用菌生产用聚丙烯塑料袋，装量为200g 左右， 121灭菌45分钟。 0070 同时将接种枪灭菌备用。 0071 二、液体菌种制备。 0072 在无菌条件下将黄瘤孢霉菌种接种至母种茄瓶培养基，。

36、母种培养基为综合PDA加富培养基，置于30恒温培养箱中培养7天，待茄瓶斜面长满即得种子；待灭菌后的液体培养基温度降至30以下进行接种，将茄瓶斜面种子用接种铲划成约0.5cm0.5cm大小的接种块，于无菌条件下转接5-6块至150mL液体菌种培养基中， 30， 170rpm/min，培养5 天，菌球比例达到体积比80以上，即得液体原种。 0073 三、菌种产孢培养。 0074 产孢培养基配方A：将灭菌培养基取出，需接上灭菌的接种枪设备，将培养基接入已灭菌的玻璃或塑料容器中，无菌塑料膜封口，待琼脂凝固后，用另一把接种枪向容器内加入 20mL液体菌种，摇。

37、晃均匀。 0075 产孢培养基配方B：需放凉至30左右，无菌条件下直接向培养料内加入10mL液体菌种，混合均匀后，平铺成约1.5cm厚度。 0076 接种后，放置于30培养箱。产孢高峰期定期取样，留用。 0077 取样方法为：培养基配方A是琼脂板培养基，黄色孢子分布于培养基表层，使用刮铲平刮收集后45烘干即得黄瘤孢霉孢子粉样品。 0078 培养基配方B为松散的固体培养料，黄色孢子分布于物料颗粒表层，需将物料取出后， 45烘干后过60目标准筛，收集筛下物即为黄瘤孢霉孢子粉获得的黄瘤孢霉孢子粉样品。 0079 将上述不同培养周期取样的获得黄瘤孢霉孢子粉样品称重后，。

38、按如下公式计算获得黄瘤孢霉产率。 0080 培养基配方A的产孢效率与培养基表面积关系密切，以单位面积的产孢量变化衡量产孢量。 0081 0082 培养基配方B的产孢效率与物料重量关系密切，主要以单位重量的产孢量变化衡说明书 6/7 页 9 CN 112143656 A 9 量产孢量。 0083 0084 试验结果表明，两种培养方式均能获得较好的黄瘤孢霉孢子粉收率，其中采用培养基A因其在培养基表层生长及产孢，因此可以获得纯度更高的黄瘤孢霉孢子粉，考虑到生产成本，产孢周期为7天适宜，产孢量为20.15mg/cm2，生产周期短；采用培养基配方B虽然生长周期略长，但。

39、具有操作简便，适用性广等优点，结合生产成本，生产周期10天为宜，其产孢量为23.20mg/g干料，见表4。 0085 表4.不同菌种对黄瘤孢霉生长及产孢的影响。 0086 注：“-” 表示未生长；“+” 表示少量产孢，“+” 表示产孢量中等，“+” 表示产孢量较大。 0087 实施例4黄瘤孢霉孢子粉的应用。 0088 将根据实施例3获得的黄瘤孢霉孢子粉可以用于外伤止血。 0089 可以为黄瘤孢霉孢子粉的药用开发提供纯度高于99的原料。说明书 7/7 页 10 CN 112143656 A 10 序列表辽宁省微生物科学研究院一种黄瘤孢霉孢子粉的制备方法 2 PatentIn 。

40、version 3.3 1 568 DNA 人工序列 1 TGCGGAGGGA TCATTACCGA GTTTACAACT CCCAAACCCC ATGTGAACCT ACCACTACGT 60 TGCTTCGGCG GGATGCCCCG GGCGCGGGCC GCAAGGCCTC AGCCCCGGAA CCAGGCGCCC 120 GCCGGAGGCC CAAACCAAAC TCTTGTTTTT ATAGAATCTT CTGAGTGGCC TTTTAGGCAA 180 CAAATGAATC AAAACTTTCA ACAACGGATC TCTTGGTTCT GGCATCGATG AAGAACG。

41、CAG 240 CGAAATGCGA TAAGTAATGT GAATTGCAGA ATTCAGTGAA TCATCGAATC TTTGAACGCA 300 CATTGCGCCC GCCAGCATTC TGGCGGGCAT GCCTGTTCGA GCGTCATTTC AACCCTCAAG 360 CCCCCCCGGG GGCCTGGTGT TGGGGACCGG CCCCGCCCCG TCGCGGGTCG CCGCCCCCTA 420 AATTCAGTGG CGGTCCTGCC GCAGCCTCCT CTGCGTAGTA GCTTTTGAAA CCTCGCACCG 480 GAGAGCGGCT CGGCCACGCC GTTAAACCCC AACTTTCTAG AGTTTGACCT CGGATCAGGT 540 AGGAATACCC GCTGAACTTA AGCATATC 568 序列表 1/1 页 11 CN 112143656 A 11 图1 说明书附图 1/1 页 12 CN 112143656 A 12 。