甜樱桃PaPME2基因在调控甜樱桃果实成熟或软化中的用途的制作方法

本发明涉及甜樱桃papme2基因的一种新用途，尤其涉及甜樱桃papme2基因在调控甜樱桃果实成熟或软化中的用途，属于papme2基因的新用途领域。

背景技术：

欧洲甜樱桃(prunusaviuml.)，属蔷薇科李属植物，是中国北方春季上市最早的鲜果，具有很高的经济价值。而且甜樱桃的果实具有极高的营养价值和保健功效，含有丰富的有机酸、维生素、氨基酸和褪黑素等，深受广大消费者的喜爱。然而甜樱桃果实成熟后迅速软化，导致甜樱桃采后极易软化腐烂、品质下降，在运输和贮藏过程中会造成大量损失，限制了甜樱桃产业的发展(宣继萍,王刚,贾展慧,郭忠仁.2015.李属植物果实成熟软化研究进展.中国农学通报,31:104-118；brummellda,dalcinv,crisostoch,labavitchjm.2004.cellwallmetabolismduringmaturation,ripeningandsenescenceofpeachfruit.journalofexperimentalbotany,55(405):2029-2039.)。因此，研究甜樱桃果实成熟软化的生理和分子机理，提高甜樱桃的耐储运和延长果实的货架期，一直是研究探讨的热点问题之一。

甜樱桃果实软化主要是由细胞壁结构的变化和细胞壁组分发生降解导致，细胞壁的主要成分为果胶和纤维素(赵云峰,林瑜,林河通.细胞壁组分变化与果实成熟软化的关系研究进展.食品科技,2012(12):29-33.)。参与细胞壁物质降解的主要是一些水解酶，如果胶甲酯酶(pectinmethylesterase,pme)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase,pg)、纤维素酶(cellulase,cx)和β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)等(brummellda,harpstermh.2001.cellwallmetabolisminfruitsofteningandqualityanditsmanipulationintransgenicplants.plantmolecularbiology,47:311-340.；宣继萍,王刚,贾展慧,郭忠仁.2015.李属植物果实成熟软化研究进展.中国农学通报,31:104-118.；brummellda,dalcinv,crisostoch,labavitchjm.2004.cellwallmetabolismduringmaturation,ripeningandsenescenceofpeachfruit.journalofexperimentalbotany,55(405):2029-2039.)。

果胶甲酯酶基因(pmes)是广泛存在于植物体内的一类较大的基因家族，分为typeⅰ和typeⅱ。pme主要催化果胶酯酸转变成果胶酸，为pg提供水解底物，与pg酶协同作用使果实软化(程杰山,沈火林,孙秀波,杨学妍,张梅,连序海,李玫瑰.果实成熟软化过程中主要相关酶作用的研究进展.北方园艺,2008(01):49-52.)。研究发现在香蕉、木瓜、芒果、草莓、番茄、葡萄和桃等园艺作物的果实成熟软化过程中，pme的酶活性明显上升，表明果胶甲酯酶在果实成熟软化中发挥重要作用(钟曼茜,从心黎,张史青,黄绵佳.外源壳聚糖涂膜处理番木瓜的常温保鲜效果.热带生物学报,2016,7(02):220-223；alizm,chinlh,lazanh.2004.acomparativestudyonwalldegradingenzymes,pectinmodificationsandsofteningduringripeningofselectedtropicalfruits.plantscience,167(2):317-327；muengkaewr,whangchaik,chaiprasartp.2018.applicationofcalcium–boronimprovefruitquality,cellcharacteristics,andeffectivesofteningenzymeactivityafterharvestinmangofruit(mangiferaindical.).horticulture,environment,andbiotechnology,59(4):537-546.harrimanrw,tiemandm,handaak.1991.molecularcloningoftomatopectinmethylesterasegeneanditsexpressioninrutgers,ripeninginhibitor,nonripening,andneverripetomatofruits.plantphysiology,97(1):80-87；nunankj,daviesc,robinsonsp,finchergb.2001.expressionpatternsofcellwall-modifyingenzymesduringgrapeberrydevelopment.planta,214(2):257-264；周厚成.草莓果实成熟软化相关基因的研究.杨凌:西北；manganarisg.a,vasilakakism,diamantidisg,mignanii.2006.diversemetabolismofcellwallcomponentsofmeltingandnon-meltingpeachgenotypesduringripeningafterharvestorcoldstorage.journalofthescienceoffoodandagriculture,86(2):243-250)。由于果胶甲酯酶是一个多基因家族，不同的果胶甲酯同工酶在果实成熟软化中发挥着不同的作用，因此有必要对果胶甲酯酶基因家族进行系统的功能研究，明晰其在果实成熟软化中的作用。甜樱桃果实成熟软化是果实衰老的主要特征之一，伴随果实品质下降，如硬度降低、质地变软等，严重影响口感及其商品价值。研究表明甜樱桃果实细胞壁成分的改变尤其是果胶组分的变化及相关酶的相互作用是导致果实软化的直接原因(brummell,2006；pellouxetal.,2007；matasetal.,2009)。然而，在甜樱桃等核果类果树中，从转录水平研究pme基因与果实成熟软化仍未报道。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供甜樱桃papme2基因在调控甜樱桃果实成熟或软化中的新用途。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明首先从甜樱桃基因组数据库中鉴定到46个papmes家族基因并进行了基因表达量分析，最终确定了12个papmes基因(即：papme1-12基因)的表达与果实的发育存在一定的关联。

其中，papme1基因的核苷酸序列为seqidno.1所示；papme2基因的核苷酸序列为seqidno.2所示；papme3基因的核苷酸序列为seqidno.3所示；papme4基因的核苷酸序列为seqidno.4所示；papme5基因的核苷酸序列为seqidno.5所示；papme6基因的核苷酸序列为seqidno.6所示；papme7基因的核苷酸序列为seqidno.7所示；papme8基因的核苷酸序列为seqidno.8所示；papme9基因的核苷酸序列为seqidno.9所示；papme10基因的核苷酸序列为seqidno.10所示；papme11基因的核苷酸序列为seqidno.11所示；papme12基因的核苷酸序列为seqidno.12所示。

为进一步明确这12个papmes基因在甜樱桃果实成熟软化中的功能。本发明利用实时荧光定量pcr技术进一步细化分析了甜樱桃果实成熟软化过程中这12个papmes基因的表达模式，然后利用甜樱桃果实的vigs技术沉默甜樱桃果实中pppmes基因的表达并分析了其对甜樱桃果实成熟软化影响；结果发现，papme2和papme9基因在果实发育前期表达量较低，在果实发育后期显著上调表达，一致持续到果实成熟，papme2基因在果实成熟软化的末期达到最大值；而papme9基因在果实成熟软化的前期(花后42天)表达量最高，随后基因下调表达；而其它的10个papmes基因(papme1、papme3、papme4、papme5、papme6、papme7、papme8、papme10、papme11、papme12)在果实发育的各个时期的表达量较低且没有一定的规律。沉默甜樱桃果实的papme2基因延缓了甜樱桃果实成熟软化，同时papme2基因沉默甜樱桃果实的果实硬度、可溶性固形物含量和可溶性果胶含量显著低于空载对照；而沉默甜樱桃果实的其他papmes基因与空载对照相比，没有显著变化。根据这些试验结果可见，papme2参与调控甜樱桃果实成熟软化过程，尤其在果实软化过程中扮演重要作用，是导致甜樱桃果实软化的关键蛋白因子。

因此，本发明提供了一种促进甜樱桃果实成熟的方法，包括：构建含有papme2基因的植物表达载体；将所构建的植物表达转化到甜樱桃中，让papme2基因在甜樱桃中进行过表达或超表达。

本发明还提供了一种培育早熟甜樱桃新品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有所述papme2基因的重组植物表达载体；(2)将所构建的重组植物表达载体转化到甜樱桃植物组织或植物细胞中；(3)培育筛选得到果实成熟提前的转基因甜樱桃新品种。

其中，所述的促进果实成熟包括使甜樱桃果实变软，果实中可溶性固形物含量或可溶性果胶含量升高等。

其中，将所述papme2基因可操作的与表达调控元件相连接，得到可以在植物中表达该基因的重组植物表达载体；该重组植物表达载体可以由5′端非编码区，papme2基因的多核苷酸序列和3′非编码区组成，其中，所述的5′端非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子可以是组成性启动子、诱导型启动子、组织或器官特异性启动子；所述的3′非编码区可以包含终止子序列、mrna切割序列等。合适的终止子序列可取自根癌农杆菌的ti-质粒，例如章鱼碱合成酶和胭脂碱合成酶终止区。

另外，本领域技术人员可以将papme2基因的多核苷酸序列进行优化以增强或改善在甜樱桃中的表达效率。

该重组植物表达载体还可含有用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因用于选择经转化的细胞或组织。标记基因包括：编码抗生素抗性的基因以及赋予除草化合物抗性的基因等。此外，所述的标记基因还包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白等。

所述的“引入”指将papme2基因导入到植物细胞内部这样的方式将多核苷酸或多肽遗传转化到甜樱桃植物中。将所述多核苷酸或多肽引入到植物中的方法为本领域所习知，包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法或病毒介导法等。“稳定转化”指被引入的多核苷酸构建体整合至植物细胞的基因组中并能通过其子代遗传；“瞬时转化”指多核苷酸被引入到植物中但只能在植物中暂时性表达或存在。

将所述papme2基因引入甜樱桃植物细胞的合适方法包括：显微注射、电穿孔、农杆菌介导的转化、直接基因转移以及高速弹道轰击等。利用常规方法可使已转化的细胞再生稳定转化植株(mccormicketal.plantcellreports.1986.5:81-84)。

本发明也可通过基因编辑技术(crispr/cas9转基因技术)或基因敲除方法，譬如构建papme2基因的基因编辑载体或敲除载体，将甜樱桃中的papme2基因进行敲除或突变，使得转基因植物的甜樱桃果实成熟进程变缓或滞后。

本发明进一步提供了一种培育硬肉、耐储运甜樱桃新品种的方法，其特征在于，包括：(1)构建含有所述papme2基因的基因编辑载体或敲除载体；(2)将所构建的基因编辑载体或敲除载体转化到甜樱桃植物组织或植物细胞中，使甜樱桃中的papme2基因被敲除或进行突变；(3)培育筛选得到硬肉、耐储运的转基因甜樱桃新品种。

本发明利用vigs技术确定了papme2在甜樱桃果实成熟软化中起着重要作用，鉴于以上研究，本发明确定papme2可能是甜樱桃果实软化相关的关键基因，为进一步解析papme基因家族在甜樱桃果实成熟软化过程中生理功能和作用机制提供了一些思路和实验基础，为明确甜樱桃果胶甲酯酶基因的功能及在果实成熟软化过程中的作用提供理论基础，同时为培育硬肉、耐储运的甜樱桃新品种提供了基因资源。

本发明所涉及的术语定义

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。

术语“重组宿主细胞”或“宿主细胞”意指包括外源性多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其他方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。

术语“多核苷酸”或“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括pna(肽核酸)、在反义技术中所用的dna类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代[batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；和cassol等人,(1992)；rossolini等人,molcell.probes8:91-98(1994)]。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

术语“转化”：将异源性dna序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。

术语“编码序列”：转录成rna的核酸序列。

术语“重组植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的dna载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：t-dna转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性dna序列等。

附图说明

图1.12个papmes基因在果实发育中表达模式。

图2.trv介导的甜樱桃果实中papmes基因的相对表达量检测。

图3.papmes基因沉默的甜樱桃果实的果实硬度和可溶性固形物含量的变化。

图4.papmes基因沉默的甜樱桃果实的可溶性果胶、纤维素含量的变化。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1vigs方法沉默甜樱桃果实中papmes基因及对果实软化的影响试验

1.材料与方法

1.1材料

植物材料：欧洲甜樱桃栽培品种‘早红珠’来自中国农业科学院郑州果树研究所樱桃种质资源圃，砧木为‘zy-1’，树龄6年，树体生长正常。

菌株和trv病毒载体：vigs载体烟草脆裂病毒载体(tobaccorattlevirus，trv)ptrv1与ptrv2由清华大学刘玉乐教授惠赠，根癌农杆菌菌种gv3101由实验室保存。

1.2试验方法

1.2.1vigs重组载体的构建及转化农杆菌

ptrv2-papme1-12载体的构建采用in-fusioncloning技术。分别设计带有16个重叠区域(与经ecori和kpni线性化的ptrv2片段互为反向互补的接头)的papme1-12基因特异性引物对papme1-2-f/r(表1)，靶标片段的选择是仅沉默单一papme基因的序列，不沉默其他papmes家族序列。

表1引物序列

以甜樱桃cdna为模板分别扩增出12个papmes的片段，利用in-fusiontmhdcloningkit(clontech,mount-ainview,ca,unitedstates)分别将12个papmes的片段构建接到经ecori和kpni双酶切线性化的ptrv2构建上，分别命名为ptrv2-papme1-12，并转入大肠杆菌dh5α感受态中，挑取阳性菌株，经pcr鉴定，双酶切鉴定和测序正确后，分别将12个ptrv2-papme1-12载体转入农杆菌菌种gv3101中备用。

1.2.3利用vigs技术瞬时转化甜樱桃果实

甜樱桃果实的vigs方法参照齐希梁等的方法(齐希梁,李明,刘聪利,宋露露.2018.trv介导欧洲甜樱桃果实vigs体系的建立.果树学报,35(11):1309-1315)进行，并进行三次生物学重复。

1.2.4半定量rt-pcr检测和实时荧光定量pcr(qpcr)分析

提取甜樱桃果实样品的总rna，并反转录成cdna，以甜樱桃的histone2(pav_sc0000671.1)基因为内参，对不同样品的cdna含量进行调节，然后分别利用papmes的基因特异性引物对papme1-12-j-f/r(表1)检测沉默后相关papmes基因的表达水平。

qpcr反应在abi7500pcr热循环仪(appliedbiosystems,fostercity,ca,unitedstates)上进行，使用transstarttopgreenqpcrsupermix(北京全式金生物技术有限公司，北京，中国)试剂盒进行反应，以甜樱桃的histone2(pav_sc0000671.1)基因为内参进行分析。并进行三次生物学重复，取平均值。

1.2.5果实硬度、可溶性固形物测定

果实硬度gy-4型硬度计测定，单位为kg·cm-2。每次随机选取5个果实，每个果实不同部位选2个点测定并进行三次重复，取平均值。可溶性固形物含量测定采用手持式糖度仪(pal-1，爱拓，日本)测定可溶性固形物含量(％)，并重复三次，取平均值。

1.2.6可溶性果胶、纤维素测定

可溶性果胶测定参考曹建康等的方法，采用咔唑硫酸比色法(曹建康,姜微波,赵玉梅.2007.果蔬采后生理生化实验指导.中国轻工业出版社)，于530nm处测定吸光度；纤维素含量的测定参考王学奎的方法，采用蒽酮比色法测定(王学奎.2006.植物生理生化试验原理和技术.教育出版社,pp:122-126.)，于620nm处测定吸光度。

1.2.7数据处理

使用microsoftexcel2010软件对所获数据处理并绘图；使用spss17.0软件进行相关性分析和差异显著性(p<0.05)分析。

2结果与分析

2.1果胶甲酯酶基因家族在果实成熟软化中表达模式分析

papmes基因家族的qpcr分析结果发现：papme2和papme9基因在果实发育初期(第一次膨大期和硬核期)基因表达量较低，随着果实的发育，基因的表达水平呈显著上调趋势，papme2基因在果实成熟软化的末期达到最大值；而papme9基因在果实成熟软化的前期(花后42天)表达量最高，随后表达量下调(图1)。其它10个papmes基因(papme1、papme3、papme4、papme5、papme6、papme7、papme8、papme10、papme11、papme12)的表达量在果实发育过程中表达量较低，且基因的表达未呈现一定的规律。如papme6、papme8、papme10、papme11和papme12基因在果实发育的整个时期基因表达量都极低；papme1、papme3、papme4、papme5和papme7基因在果实发育初期表达量较低，随着果实的发育基因的表达呈上调趋势，而且基因的表达量在果实发育中期或后期出现一个峰值，随后下调表达(图1)。

2.2.vigs沉默甜樱桃果实papmes基因家族的rt-pcr检测

本试验采用半定量rt-pcr方法分别检测甜樱桃果实的12个papmes基因的沉默效率，由于本试验的方法中仅扩增单一papme基因的特异性的靶标片段(避开papmes基因家族的保守序列信息)，因此本试验仅分别检测单一的papme基因是否被沉默即可。分别提取接种后10d的甜樱桃果实的总rna，以甜樱桃histone2为内参基因进行rt-pcr分析。

检测结果显示：12个papmes基因在分别被侵染的甜樱桃果实中的mrna表达量显著降低(图2)。且通过quantityone软件定性分析发现，papmes基因被沉默的甜樱桃果实中的表达量与阴性对照相比，下降了60％～85％(图2)。上述实验结果表明甜樱桃果实中papmes基因分别被有效的沉默。

2.3papmes家族沉默对甜樱桃果实软化的影响

2.3.1对果实硬度和可溶性固形物的影响

果实硬度和可溶性固形物含量是反映果实成熟软化的重要指标。为了分析papmes基因在果实成熟软化中的作用，本试验对12个papme基因沉默的甜樱桃果实的果实硬度和可溶性固形物含量的变化进行了分析，结果显示：papme2基因沉默的甜樱桃果实的果实硬度与阴性对照相比，显著高于阴性对照的果实硬度；同样地，papme2基因沉默的甜樱桃果实的可溶性固形物含量显著低于阴性对照(图3)。而其他papmes基因沉默的甜樱桃果实的果实硬度和可溶性固形物含量与对照相比不显著(图3)。综上实验结果表明：papme2基因与甜樱桃的果实软化紧密相关。

2.3.2对可溶性果胶含量的影响

果实中可溶性果胶的含量与果实的成熟软化密切相关，为进一步分析papmes基因对果实成熟软化中的影响，本试验对12个papme基因沉默的甜樱桃果实中可溶性果胶的含量进行测量分析。

测量分析结果如图4所示：与对照相比，papme2基因沉默的甜樱桃果实中可溶性果胶的含量显著低于对照组；而其它papmes基因沉默的甜樱桃果实中可溶性果胶的含量与对照相比不显著(图4)。综上实验结果表明：甜樱桃果实中papme2基因的表达量与果实中的可溶性果胶质的含量密切相关，进一步影响果实的成熟软化。

2.3.3对纤维素含量的影响

在果实成熟软化过程中，纤维素的含量也是反映果实成熟软化的重要评价指标。为进一步明确papmes基因在果实成熟软化过程中功能。本试验测定分析了12个papmes基因沉默的甜樱桃果实中纤维素含量。

分析结果显示：12个papmes基因沉默的甜樱桃果实中纤维素含量与对照相比基本一致(图4)，表明甜樱桃papmes基因的表达量与果实中纤维素的含量的变化无关。

序列表

<110>中国农业科学院郑州果树研究所

<120>甜樱桃papme2基因在调控甜樱桃果实成熟或软化中的用途

<130>hn-2002-190826a

<160>12

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>627

<212>dna

<213>prunusaviuml

<400>1

atgggagctcaaactttcacaaccccaacctcaaattcaaacaatgctctcacatttctc60

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