一种莽吉柿果皮来源外泌体样纳米囊泡及其制备方法与应用

(一)本发明涉及一种莽吉柿果皮来源外泌体样纳米囊泡及其制备方法与应用。

背景技术：

0、(二)背景技术

1、胶质瘤是发生在中枢神经系统的恶性肿瘤。胶质瘤常在大脑的深部或脑干位置发生，生长速度较快，具有侵袭性和复发性。患者常见的症状包括头痛、恶心、视力模糊、癫痫等。治疗胶质瘤的方法通常包括手术切除肿瘤、放疗辅以替莫唑胺等。然而，由于胶质瘤的侵袭性和复发性，治疗效果并不理想，预后较差，超过50％的患者无法在替莫唑胺治疗中受益。胶质瘤患者中位生存期一般小于15个月，成人患者5年生存率低于5％，需要更安全有效的治疗方法和药物。

2、与其他实体瘤不同，胶质瘤微环境主要由巨噬细胞和小胶质细胞主导，往往具有高度免疫抑制型，缺乏大量的t细胞浸润，因此，胶质瘤免疫抑制型微环境是免疫疗法的一大障碍。小胶质细胞属于脑内固有的免疫细胞，小胶质细胞活化与抗原募集、细胞碎片清除、细胞因子产生有关，并且具有可塑性，调节胶质瘤微环境的小胶质细胞可以提高免疫治疗的疗效。小胶质细胞从功能上分为m1型和m2型，m1促炎型小胶质细胞发挥抗肿瘤作用，而m2抗炎型小胶质细胞分泌il-10、tgf-β等，促进肿瘤生长、血管生成和侵袭。因此，促进胶质瘤微环境中的小胶质细胞从m2型转化为m1型是一种潜在的策略。

3、植物来源的外泌体纳米囊泡(plant exosome-like nanovesicles，pelnvs)是近年来被广泛报道的一类天然活性物质，被认为是人类、植物、动物及微生物族群中传递信息的关键物质。pelnvs具备一系列细胞成分，包括rna、dna、脂质、蛋白质和其他药理活性分子，它们可在动植物体内作为信使介导信号传导和基因表达调控，进而发挥抗炎、抗纤维化和抗肿瘤活性，具有跨物种的特点。最近的研究揭示了pelnvs跨种族间的相互作用，青蒿、人参、玫瑰花等植物的纳米囊泡能够诱导哺乳动物免疫细胞中的免疫刺激信号增加免疫细胞侵润，阻碍肿瘤的生长。

4、莽吉柿(garcinia mangostana l.)是藤黄科(guttiferae)藤黄属(garcinia)植物，别名山竹，是一种种间杂交的异源多倍体果实。莽吉柿作为传统中药，被用作治疗腹痛、疟疾、止血等，现代研究显示其果皮中的提取物——蒽酮衍生物有较好的抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等治疗作用。据报道，莽吉柿果皮提取物具备高效的抗胶质瘤活性，其能够显著诱导细胞凋亡的发生，抑制胶质瘤的生长。但是，对莽吉柿果皮来源外泌体样囊泡(gelnvs)的研究仍是空白。

技术实现思路

0、(三)
技术实现要素：

1、本发明目的是提供一种莽吉柿果皮来源外泌体样纳米囊泡及其制备方法与应用，本发明通过酶解、碾碎、差速离心、蔗糖密度梯度纯化、超滤、过滤步骤，从纤维或果胶含量较高、难溶性物质较多的根茎或果皮中提取植物来源的外泌体样纳米囊泡，具有产量高、成本低的优点，同时获得的外泌体样纳米囊泡兼具抗胶质瘤能力和免疫刺激能力，有望为胶质瘤的治疗提供一种新方法。

2、本发明采用的技术方案是：

3、本发明提供一种莽吉柿果皮来源外泌体样纳米囊泡(记为gelnvs)，所述外泌体样纳米囊泡按如下方法制备得到：

4、(1)酶消化：新鲜莽吉柿果皮块，浸入pbs中，加入酶于37℃消化2h以除去纤维、果胶等影响外泌体沉淀的杂质；

5、(2)捣碎匀浆：步骤(1)消化后的混合物调节ph至中性避免酸性环境破坏外泌体样纳米囊泡，然后在4℃预冷的pbs中捣碎匀浆后过300目滤网，收集滤液；

6、(3)差速离心：步骤(2)收集的滤液先在2000-4000×g，4℃低速离心0.5-1h以除去细胞、原生质体等大颗粒杂质，收集上清；再在10000-20000×g，4℃高速离心0.5-1.5h以除去细胞碎片和大囊泡，收集上清，通过差速离心的方式除去匀浆中的大颗粒杂质；

7、(4)超速离心：步骤(3)上清在100000-150000×g，4℃条件下离心1-2h，收集沉淀用0.02m ph7.4 tris-hcl缓冲液重悬；

8、(5)蔗糖密度梯度纯化：用0.02m ph7.4的tris-hcl分别配制蔗糖质量浓度8-60％的蔗糖溶液，按照浓度由高到低依次加入超速离心管中，最后加入步骤(4)重悬液，150000×g，4℃离心2h，收集30％-45％蔗糖溶液层；所述各个浓度蔗糖溶液与重悬液加入体积比均为1:1；

9、(6)过滤：步骤(5)蔗糖溶液层在5000×g，4℃条件下离心0.5h进行超滤以去除蔗糖溶液，沉淀用0.02m ph7.4 tris-hcl缓冲液重悬(gelnvs在0.02m ph7.4tris-hcl溶液中的溶解度更大)，过0.22μm的滤网，收集截流液，得到外泌体样纳米囊泡。

10、进一步，步骤(1)加入的酶为纤维素酶和果胶酶，其中纤维素酶酶活为5-10u/mg，优选8u/mg，加入量为莽吉柿果皮块质量的1-5％(优选2％)；果胶酶酶活为0.1-2u/mg，优选1u/mg，加入量为莽吉柿果皮块质量的0.1-1％(优选0.2％)；所述莽吉柿果皮块加入量以pbs体积计为80-90g/100ml。

11、进一步，步骤(2)使用naoh调节ph至7.4。

12、进一步，步骤(2)捣碎匀浆是指将调节ph后的混合物加入4℃预冷的pbs中，5000rpm低速搅拌1min，再加入等体积4℃预冷的pbs，20000rpm高速搅拌0.5min，重复低速-高速搅拌3次进行捣碎匀浆；所述pbs总量与步骤(1)pbs体积比为1:2。

13、进一步，步骤(3)中，低速离心是3000×g，4℃离心30min；高速离心是15000×g，4℃离心1h。

14、进一步，步骤(4)中，120000×g，4℃条件下离心1.5h。

15、进一步，考虑到生物安全性，避免在提取过程中引入有毒化合物，步骤(5)中密度梯度离心采用安全温和的蔗糖溶液作为溶剂，密度梯度分别设置为8％、15％、30％、45％、60％，制备蔗糖溶液时需在冰上进行以防止不同密度的蔗糖溶液混为一体。

16、本发明提取过程中使用的pbs缓冲液ph 7.4，所有捣碎、离心步骤在冰浴或者4℃进行以防止高温破坏gelnvs。

17、本发明还提供一种所述外泌体样纳米囊泡在制备免疫激动剂中的应用，所述免疫激动剂为刺激bv2细胞向m1表型极化的制剂，即促进免疫抑制环境中bv2小胶质细胞炎症介质表达升高，有效刺激bv2细胞向m1表型极化以逆转胶质瘤免疫抑制微环境。

18、本发明还提供一种所述外泌体样纳米囊泡在制备抗肿瘤药物中的应用，所述肿瘤包括胶质瘤。

19、进一步，所述抗肿瘤药物为抑制肿瘤细胞活性的药物，所述肿瘤细胞包括gl261胶质瘤细胞。

20、与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

21、(1)本发明首先通过酶消化去除高纤维或高果胶的植物组织中影响外泌体样纳米囊泡沉降的杂质，再通过均质、差速离心、超速离心，蔗糖密度梯度离心，最后过滤的方法，能够高效获得高纯度的外泌体样纳米囊泡。

22、(2)本发明方法制备的莽吉柿果皮来源的外泌体样纳米囊泡可以被免疫细胞与肿瘤细胞摄取，具有跨物种特性。

23、(3)本发明莽吉柿果皮来源的外泌体样纳米囊泡兼具抗胶质瘤能力和免疫刺激能力，有望为胶质瘤的治疗提供一种新方法。

24、cck8细胞毒性实验发现，在25-300μg/ml浓度范围内，莽吉柿果皮来源的外泌体样纳米囊泡显著抑制gl261细胞的增殖，而对bv细胞无明显毒性(细胞活力大于90％)，具有高效且安全的抗肿瘤效果。

25、流式细胞术检测发现，100μg/ml的莽吉柿果皮来源的外泌体样纳米囊泡能诱导gl261细胞凋亡，且能有效刺激bv2细胞向m1表型极化以逆转胶质瘤免疫抑制微环境，证明其兼具抗肿瘤和免疫刺激能力。

26、no检测和rt-qpcr检测发现100μg/ml的莽吉柿果皮来源的外泌体样纳米囊泡能促进免疫抑制环境中bv2细胞炎症介质表达升高，抗炎方向标志物表达降低，是一种有潜力的免疫激动剂。

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