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10分+，新型植物源性长春花外泌体通过TNF

来源：花匠小妙招时间：2024-10-31 19:35

2024-09-06 10:27 点击次数：177 关键词：植物外泌体；外泌体鉴定；RT-PCR检测

植物源性外泌体样纳米囊泡（PDENs)在疾病治疗和药物传递方面具有优势，但对其生物发生、成分分析和关键标记蛋白的研究仍处于起步阶段，这限制了PDENs的标准化生产。有效制备PDENs仍然是一个重大挑战。

植物外泌体提取

湾湾今天分享的是发表在【Journal of Nanobiotechnology】（IF:10.6）上题为“Novel plant-derived exosome-like nanovesicles from Catharanthus roseus: preparation, characterization, and immunostimulatory effect via TNF-α/NF-κB/PU.1 axis”的研究，该研究报道了一种具有优异稳定性和良好生物相容性的新型PDENs，长春花叶源性外泌体样囊泡（CLDENs）。该研究揭示了CLDENs的生物发生、成分组成、稳定性、生物相容性以及生物分布特征，并通过TNF-α/NF-κB/PU.1轴显示其免疫调节活性。该研究还证明了将植物培养技术应用于大规模生产PDENs的可行性。

植物外泌体提取

研究成果

1、长春花中外泌体样囊泡的分离，CLDENs的物理化学表征

外泌体提取鉴定

图1A：CLDENs的分离过程示意图。

图1B：CLDENs的TEM分析。

图1C：DLS检测CLDENs的粒径分布。

图1D：纳米流分析仪检测CLDENs的颗粒尺寸。

图1E：CLDENs的zeta表面电荷分析。结果表明，zeta电位值处于-30mV~+30Mv，说明囊泡稳定。

图1F：CLDENs在含表面活性剂环境下的粒径变化。结果表明，表面活性剂能够分解CLDENs。

图1G：CLDENs在含酶环境下的粒径变化。结果表明， CLDENs能抵抗DNase、RNase 和蛋白酶的消化。

图1H：（a-c）CLDENs在pH＝6.92、pH＝13.58、pH＝1.83环境中的粒径变化,（d-f）CLDENs在pH＝6.92、pH＝13.58、pH＝1.83环境中的TEM图像。结果表明，CLDENs在酸性或碱性环境中，仍能保持囊泡样结构，没有明显破裂。

2、CLDENs的生物相容性和生物分布

外泌体鉴定

图2A：CLDENs摄取后随时间推移在细胞内的积累。白色三角形用于标记RAW264.7细胞摄入CLDENs后的形态变化。

图2B：CLDENs对HIEC-6细胞、L-02细胞、RAW264.7细胞的细胞毒性测定。结果表明，细胞存活率在70％以上，CLDENs是相对安全的纳米囊泡。

图2C：使用绵羊血液进行CLDENs的溶血试验。结果表明，CLDENs的溶血率较低超过1％，CLDENs具有良好的生物相容性。

图2D：（a）37℃下在PBS中孵育后，CLDENs的粒径分布变化,（b）37℃下在胃模拟液中孵育后，CLDENs的粒径分布变化,（c）37℃下在小肠模拟液中孵育后，CLDENs的粒径分布变化。结果表明，37℃放置12小时，CLDENs的粒径不会受到影响。置于小肠模拟液和胃模拟液时，可以保持稳定性至少12小时。CLDENs具有良好的稳定性。

体内成像

图3A：（a）口服给药后，CLDENs在小鼠体内的生物分布,（b）腹腔注射后，CLDENs在小鼠体内的生物分布,（c）尾静脉注射后，CLDENs在小鼠体内的生物分布。

图3B：腹腔给药后，CLDENs在器官中的生物分布。（a）脑、心、肝、脾、胸腺、肺、肾中的荧光信号,（b）胃肠道荧光信号。

上述结果说明，不同的给药方式会导致CLDENs表现出截然不同的生物分布。数据表明CLDENs可能具有优异的抗胃酸消化率，并且口服后可以在肠道保留很长时间。此外，通过腹腔注射可以实现免疫器官靶向分布。静脉注射到血流中的CLDENs可能会被肝脏和脾脏拦截和快速清除。

3、CLDENs的成分分析

生信分析

图4A：CLDENs的脂质组学分析。结果表明，CLDENs主要含有EtherPC、PG、PI、EtherPG。

图4B：CLDENs的代谢组学分析。结果表明，CLDENs主要含有氨基酸、脂肪酸和脂质、生物碱和碳水化合物等化合物。

图4C：CLDENs组中鉴定蛋白的分子量分布。

图4D：火山图蛋白质组学分析。

图4E：差异上调和下调表达蛋白的数量。

图4F：差异表达蛋白和上调蛋白的亚细胞定位。

图4G：下调蛋白的亚细胞定位。

上述结果说明，在 CLDENs中显着富集的这些蛋白质中，发现了与多囊泡和腔内囊泡相关的蛋白质，这些蛋白质的富集提供了CLDENs起源于 MVB 的证据。

4、CLDENs通过TNF-α/NK-κ/PU.1轴的免疫刺激作用

RT-PCR检测

图5A：CLDENs促进RAW264.7细胞分泌细胞因子TNF-α和IL-6，而对IL-1β和IL-10的分泌无明显促进作用。

图5B：CLDENs促进RAW264.7细胞释放NO。

图5C：CLDENs增加了RAW264.7细胞iNOS的表达水平。

图A-C的结果表明，CLDENs促进巨噬细胞分泌多种细胞因子并激活炎症反应。

图5D：CLDENs对RAW264.7细胞吞噬FITC-葡聚糖能力的影响的平均荧光强度。结果表明，CLDENs显着增强RAW264.7细胞的吞噬功能。

图5E：CLDENs对RAW264.7细胞吞噬FITC-葡聚糖能力的影响的直方图。

图5F-G：CLDENs增强RAW巨噬细胞表面抗原CD86和MHC II的表达，但对CD206的表达没有明显的影响。F：直方图。G：平均荧光强度。

图5H：CLDENs增加RAW264.7细胞中M1型相关基因的mRNA转录水平。

图5I：CLDENs降低RAW264.7细胞中M2型相关基因的mRNA转录水平。

图5J：CLDENs激活了NK-κB信号通路的传导。

图5K：CLDENs上调RAW264.7细胞中PU.1蛋白的表达水平。

图5L：CLDENs上调RAW264.7细胞PU.1基因mRNA转录量。

图5M：CLDENs对原代脾淋巴细胞活力的影响。

图5N：CLDENs促进原代脾淋巴细胞分泌IL-2。

上述结果表明，CLDENs促进免疫细胞的增殖和分化，并促进其在体外的功能激活。这种免疫调节作用是通过 TNF-α/NF-κB/PU.1介导的。

5、CLDENs减轻环磷酰胺诱导的免疫抑制

HE染色

图6A：CLDENs对免疫小鼠抑制外周血中白细胞数量的影响。

图6B：CLDENs对免疫小鼠抑制外周血中淋巴细胞数量的影响。

图6C：CLDENs对免疫小鼠抑制外周血中中性粒细胞数量的影响。

图6D：CLDENs对免疫小鼠抑制外周血中单核细胞数量的影响。

图A-D结果表明，中剂量和高剂量CLDENs显着逆转环磷酰胺对血细胞计数的抑制作用。对于低剂量组，CLDENs显着减轻了白细胞、淋巴细胞的下降。

图6E：CLDENs对环磷酰胺免疫抑制模型小鼠血清中细胞因子TNF-α分泌水平的影响。

图6F：CLDENs对环磷酰胺免疫抑制模型小鼠血清中细胞因子IL-2分泌水平的影响。

图6G：CLDENs对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞亚群数量的影响。

图6H：CLDENs对免疫抑制小鼠脾淋巴细胞亚群比例的影响。

图E-H：这些结果表明CLDENs通过提高淋巴细胞亚群的比例来促进免疫功能的正向调节。

图6I：CLDENs对免疫小鼠清除碳颗粒能力的影响。

图6J：CLDENs对小鼠骨髓细胞周期分布的影响。

图6K：CLDENs对环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠相对体重增加的影响。

图6L：通过HE染色分析CLDENs对环磷酰胺诱导的免疫免疫抑制小鼠的肝和肾的影响。

图6M：HE染色检测肝和肾的组织学变化。

图I-M：结果表明，CLDENs 给药后能够逆转环磷酰胺引起的病变。

上述结果共同表明， CLDENs减轻了环磷酰胺引起的免疫抑制。

6、植物细胞培养技术应用于CLDENs生产

外泌体鉴定

图7A：CrDDENs的TEM分析。

图7B：纳米流分析仪测量CrDDENs的粒径分布。

图7C：CrDDENs的zeta电位分析。

图7D：CrCDENs的TEM分析。

图7E：纳米流分析仪测量CrCDENs的粒径分布。

图7F：CrCDENs的zeta电位分布。

图A-F结果表明，CrDDENs与CLDENs具有高度相似的物理特性，CrCDENs在粒径和zeta 电位方面与CLDEN不同。

图7G：CrDDENs和CrCDENs对多种细胞系的细胞毒性试验。

图7H：CrDDENs和CrCDENs促进RAW264.7细胞NO释放。

图7I：CrDDENs和CrCDENs促进RAW264.7细胞分泌细胞因子。

图7J：CrDDENs诱导RAW264.7细胞向M1型极化。

图G-J结果表明，对于不同组织来源的PDENs，其生物活性可能并不相同。

上述结果表明，通过植物细胞培养技术生产PDENs的可行性。

结论

该研究从长春花叶（CLDENs）分离出新型的PDENs，在CLDENs中鉴定出高含量的醚磷脂、MVB相关蛋白和六种标记蛋白。这些发现为PDENs的生物形成和活动追踪提供了启发。CLDENs可以被巨噬细胞内化，并能经受恶劣条件的pH环境和各种酶的消化。另外，CLDENs经腹腔注射后具有免疫器官靶向性，并通过建立TNF-α/NF-κB/PU.1减轻环磷酰胺诱导的免疫机制。为了确保CLDENs的稳定性，该研究建立了长春花植物细胞培养体系，以提供具有相似物理特性和生物活性的类CLDENs纳米囊泡。结果表明，CLDENs可能是一种潜在的免疫调节材料，可以大规模应用于工业应用。