一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法与流程

本发明涉及一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法，属于林木杂交育种技术领域。

背景技术：

杨树是我国的主要经济树种之一，杨木的用途很广，不仅用作于木材，而且主要用于加工业用材，杨树已成为胶合板、纤维板、造纸火柴、卫生筷和包装业的重要加工原料。种植杨树，不仅有巨大的经济效益，而且有很大的生态效益和社会效益。因此大力发展杨树速生丰产林，对于满足我国木材市场需求、减少对外木材依赖、更有效保护天然林意义重大。

目前，杂交育种是获得杨树品种的主要渠道。杨树的传统杂交育种方法主要有两种，一种是在室外大田的杨树母株上进行人工授粉杂交，另一种是在室内应用切枝水培进行的杂交育种。第一种杂交育种方法的优点是蒴果自然发育成熟，能够得到大量种子从而可以进行高强度选择，蒴果发育期管理比较简单，种子质量较好；其缺点是因为需要在母本植株树体周围设置与母本植株几乎等高的架子，另外还需要进行套袋隔离，费用高，安全性差，操作不方便；第二种杂交育种方法费用低，操作和管理方便，种子采收方便，因而是目前国内外杨树杂交育种普遍采用的方法，但室内切枝水培法的缺点是由于种子的发育所需营养完全来源于切枝中贮藏的养分,常常因授粉后营养不足而导致出现败育现象，种子产量低，质量差,尤其是美洲黑杨，出现败育的现象特别严重，水培几乎不可能成功。

技术实现要素：

本发明的目的在于解决现有技术中杨树的室内切枝水培法存在的问题，提供一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法，该方法可以用于对授粉后出现败育现象的种子进行组织培养，使成功获得杂交苗。该方法特别适合于美洲黑杨的室内花枝水培。

技术方案

一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法，包括如下步骤：

(1)采集花枝：采集花枝在2月上旬进行，取长度100-300cm，直径大于5cm的无病虫害、花芽饱满的杨树枝条；

(2)插条及培养：将雌雄花枝分开置于20-30℃的温室水培，每天换一次水；

(3)授粉：待雄花开后开始收集花粉，将花粉置于干燥器中干燥，然后4℃低温保存，当雌花开放，柱头打开时，即进行授粉，将花粉涂到柱头上，持续授粉3d，每天2-3次；

(4)胚拯救：

a.若授粉后三周内出现败育的情况，对外植体消毒后，将未发育完全的子房，放置在子房生长培养基上培养10-14d后，剥出种子进行胚拯救；

b.若授粉后三周后才出现败育的情况，取下发黑的、未成熟的蒴果，清洗并消毒后，剥出种子，直接进行胚拯救；

所述胚拯救的方法是：将种子置于胚拯救培养基上进行组织培养，培养7-14d后，按长出幼苗和没长出幼苗分两步进行：

1)长出幼苗：将长出的幼苗转移到生根培养基上进行培养，得到无菌苗，无菌苗长大后移植，得到杂交苗；

2)没长出幼苗：将在胚拯救培养基上培养14d没长出幼苗的种子用愈伤诱导培养基诱导出愈伤组织，然后用芽分化培养基诱导出芽，最后转生根培养基上进行培养，得到无菌苗，无菌苗长大后移植，得到杂交苗。

进一步，步骤(4)中，所述消毒方法是：先用70％酒精消毒30s，无菌水冲洗三次后，再用2％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗三次。

进一步，步骤(4)中，所述子房生长培养基的配方：ms+naa2mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

进一步，步骤(4)中，所述胚拯救培养基的配方：ms+naa0.5mg/l+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

进一步，步骤(4)中，所述生根培养基的配方：ms+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

进一步，步骤(4)中，所述愈伤诱导培养基的配方：ms+6-ba0.4mg/l+naa0.04mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

进一步，步骤(4)中，所述芽分化培养基的配方：ms+6-ba0.4mg/l+tdz(噻苯隆)0.01mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

进一步，步骤(4)中，所述培养条件为：温度20-30℃，光照强度200-250umol/m2s-1，湿度40％-45％。

本发明的有益效果：本发明提供了一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法，有效克服了杨树的传统水培法过程中存在的种子败育从而导致杂交失败的问题，特别适合于美洲黑杨的水培，本发明采用胚拯救的方法，对未发育完全的种子进行组织培养，最终获得大量杂交苗，方法简单，节省了杨树的育种时间，避免了资源浪费。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

值得说明的是，下述实施例中，杨树品种为美洲黑杨，但不限于此。下述实施例中，子房生长培养基的配方：ms+naa2mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。胚拯救培养基的配方：ms+naa0.5mg/l+6-ba0.5mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。生根培养基的配方：生根培养基的配方：ms+naa0.1mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。愈伤诱导培养基的配方：ms+6-ba0.4mg/l+naa0.04mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。芽分化培养基的配方：ms+6-ba0.4mg/l+tdz0.01mg/l+蔗糖30g/l+phytagel3g/l，ph5.8。

实施例1

一种利用胚拯救获得杨树杂交苗的方法，包括如下步骤：

(1)采集花枝：采集花枝在2月1日进行，取长度100-300cm，直径大于5cm的无病虫害、花芽饱满的杨树枝条；

(2)插条及培养：将雌雄花枝分开置于20-30℃的温室水培，每天换一次水；

(3)授粉：待雄花开后开始收集花粉(2月20日至2月25日)，将花粉置于干燥器中干燥，然后4℃低温保存，当雌花开放，柱头打开时，即进行授粉，将花粉涂到柱头上，持续授粉3d，每天2-3次；

(4)胚拯救：

a.若授粉后三周内出现败育的情况，对外植体消毒(在超净工作台中用70％酒精消毒30s，无菌水冲洗三次后，用2％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗三次)后，将未发育完全的子房，放置在子房生长培养基上培养(温度23℃，光照强度200-250umol/m2s-1，湿度40％-45％)10-14d后，剥出种子进行胚拯救；本实施例中，共处理了5颗子房，剥出98颗种子，得到苗12棵，成苗率12.24％；

b.若授粉后三周后才出现败育的情况，取下发黑的、未成熟的蒴果，清洗并消毒(在超净工作台中用70％酒精消毒30s，无菌水冲洗三次后，用2％次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗三次)后，剥出种子412颗，直接进行胚拯救；

所述胚拯救的方法是：将510颗种子置于胚拯救培养基上进行组织培养(温度23℃，光照强度200-250umol/m2s-1，湿度40％-45％)，培养7-14d后，按长出幼苗和没长出幼苗分两步进行：

1)长出幼苗：将长出的幼苗转移到生根培养基上进行培养(温度23℃，光照强度200-250umol/m2s-1，湿度40％-45％)，得到无菌苗，无菌苗长大后移植，得到81个杂交苗；

2)没长出幼苗：将在胚拯救培养基上培养14d没长出幼苗的种子用愈伤诱导培养基诱导出愈伤组织119个，然后用芽分化培养基诱导出芽，最后转生根培养基上进行培养(温度23℃，光照强度200-250umol/m2s-1，湿度40％-45％)，得到无菌苗，无菌苗长大后移植，得到108个杂交苗。

本实施例中采用胚拯救技术一共处理了510颗种子，长出幼苗81颗，发育成愈伤组织的119个，愈伤诱导后长出苗的有108个，完全没有变化的种子310颗，总成苗率为(108+81)/510＝37.06％。

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