利用发育型启动子增加基因编辑和定点整合事件制造技术

本公开提供了利用经指导的核酸内切酶和花细胞优选或花组织优选启动子增加基因组编辑和定点整合事件的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】

本公开涉及涉及在植物的花细胞和花组织中表达经指导的核酸酶和指导核酸的组合物和方法。相关申请的交叉引用本申请要求于2022年3月29日提交的美国临时申请号63/324,880的权益，其内容以其整体并入本文。序列表的纳入名为“p34740wo00_sl.xml”的文件包含序列表，其为121千字节(在中测量)并且创建于2023年3月27日，通过电子递交并且通过引用以其整体并入。

技术介绍

1、crispr(成簇的规则间隔的短回文重复)核酸酶(例如cas12a、casx、cas9)是通过指导rna引导至靶核酸分子的蛋白质，其中核酸酶可以切割靶核酸分子的一条或两条链。

技术实现思路

0、专利技术概述

1、在一个方面，本公开提供了植物，其包含(a)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子或花细胞优选启动子可操作地连接；和(b)第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述至少一种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与所述植物的基因组内的靶序列杂交。

2、在一个方面，本公开提供了编辑植物基因组的方法，其包括：(a)向植物细胞中引入：(i)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花细胞优选启动子可操作地连接；和(ii)第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述至少一种指导核酸与异源第二启

3、在一个方面，本公开提供了编辑植物细胞基因组的方法，其包括：(a)将第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物包含第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子可操作地连接，并且其中所述第二植物包含第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与所述基因组内的靶序列杂交；以及(b)从步骤(a)的杂交中获得至少一个胚，其中所述经指导的核酸酶和所述至少一种指导核酸在所述至少一个胚内形成核糖核蛋白，并且其中所述核糖核蛋白在所述至少一个胚的靶序列内产生至少一个双链断裂。

4、在一个方面，本公开提供了编辑植物基因组的方法，其包括：(a)向植物细胞中引入：(i)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子可操作地连接；和(ii)第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述至少一种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与所述基因组内的靶序列杂交；(b)从步骤(a)的植物细胞再生至少一种植物；以及(c)使所述至少一种植物受精以产生至少一个胚，其中所述经指导的核酸酶和至少一种指导核酸在来自步骤(c)的所述至少一个胚内形成核糖核蛋白，并且其中所述核糖核蛋白在所述至少一个胚的靶序列内产生至少一个双链断裂。

5、在一个方面，本公开提供了在植物中产生定点整合的方法，其包括：(a)向植物细胞中引入：(i)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花细胞优选启动子可操作地连接；(ii)第二核酸序列，其编码一种或多种指导核酸，所述一种或多种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述一种或多种指导核酸是(a)能够与植物的基因组内的靶序列杂交；和(b)能够与编码目标基因的核酸序列侧接的第一位点和第二位点杂交；以及(iii)第三核酸序列，其编码目标基因；以及(b)从步骤(a)的植物细胞再生至少一种植物；其中所述经指导的核酸酶和至少一种指导rna在所述植物的至少一个花细胞内形成核糖核蛋白，其中所述核糖核蛋白在所述靶序列、所述第一位点和所述第二位点内产生双链断裂，并且其中所述目标基因整合到所述至少一个花细胞中的所述靶位点中。

6、在一个方面，本公开提供了在植物中产生定点整合的方法，其包括：(a)向植物细胞中引入：(i)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子可操作地连接；(ii)第二核酸序列，其编码一种或多种指导核酸，所述一种或多种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述一种或多种指导核酸是(a)能够与植物的基因组内的靶序列杂交；和(b)能够与编码目标基因的核酸序列侧接的第一位点和第二位点杂交；(iii)第三核酸序列，其编码目标基因；(b)从步骤(a)的植物细胞再生至少一种植物；以及(c)使来自步骤(b)的至少一种植物受精以产生至少一个胚；其中所述经指导的核酸酶和至少一种指导rna在至少一个胚内形成核糖核蛋白，其中所述核糖核蛋白在所述靶序列、所述第一位点和所述第二位点内产生双链断裂，并且其中所述目标基因整合到所述至少一个胚中的所述靶位点中。

7、在一个方面，本公开提供了重组dna构建体，其包含(a)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子可操作地连接；和(b)第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述至少一种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与植物的基因组内的靶序列杂交。

8、在一个方面，本公开提供了编辑植物基因组的方法，其包括：(a)向植物细胞中引入：(i)第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花细胞优选启动子可操作地连接，和(ii)第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述至少一种指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与所述基因组内的靶序列杂交；和(b)从步骤(a)的植物细胞再生至少一种植物，其中所述经指导的核酸酶和至少一种指导核酸在所述植物的至少一个花细胞内形成核糖核蛋白，并且其中所述核糖核蛋白在所述至少一个花细胞的靶序列内产生至少一个双链断裂。

9、在一个方面，本公开提供了编辑植物细胞基因组的方法，其包括：(a)将第一植物与第二植物杂交，其中所述第一植物包含第一核酸序列，其编码经指导的核酸酶，所述经指导的核酸酶能够在双链dna分子中产生交错切割，所述双链dna分子与异源花组织优选启动子可操作地连接，并且其中所述第二植物包含第二核酸序列，其编码至少一种指导核酸，所述指导核酸与异源第二启动子可操作地连接，其中所述至少一种指导核酸能够与所述基因组内的靶序列杂交；以及(b)本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.植物，其包含：

2.根据权利要求1所述的植物，其中所述经指导的核酸酶选自下组：Cas12a、和CasX。

3.根据权利要求2所述的植物，其中所述第一核酸序列包含与SEQ ID NO:32或SEQ IDNO:36至少90％相同的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的植物，其中所述花细胞优选启动子是花细胞特异性启动子或其中所述花组织优选启动子是花组织特异性启动子。

5.根据权利要求1所述的植物，其中所述花细胞优选启动子选自下组：A基因启动子、B基因启动子、C基因启动子、D基因启动子和E基因启动子，或其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子选自下组：AP1启动子、AP2启动子、ZAP1启动子、AP3启动子、PI启动子、ZMM16启动子、ZMM18启动子、AG启动子、ZAG1启动子、ZMM2启动子、ZMM23启动子、AGL11/STK启动子、AGL1/SHP1启动子、AGL5/SHP2启动子、ZAG2启动子、ZMM1启动子、SEP1启动子、SEP2启动子、SEP3启动子、SEP4启动子、ZAG3启动子和ZMM7/SEP样启动子，或其中所

6.根据权利要求1所述的植物，其中所述第一或第二启动子选自下组：组织优选启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和组成型启动子，或其中所述第一或第二启动子是花细胞优选启动子或花组织优选启动子。

7.根据权利要求1所述的植物，其中所述第一或第二启动子选自下组：A基因启动子、B基因启动子、C基因启动子、D基因启动子和E基因启动子，或其中所述第一或第二启动子选自下组：AP1启动子、AP2启动子、ZAP1启动子、AP3启动子、PI启动子、ZMM16启动子、ZMM18启动子、AG启动子、ZAG1启动子、ZMM2启动子、ZMM23启动子、AGL11/STK启动子、AGL1/SHP1启动子、AGL5/SHP2启动子、ZAG2启动子、ZMM1启动子、SEP1启动子、SEP2启动子、SEP3启动子、SEP4启动子、ZAG3启动子和ZMM7/SEP样启动子，或其中所述第一或第二启动子包含与选自SEQ ID NO:1-30或选自SEQ ID NO:1-16、18-19、21-30、45-49的核酸序列至少90％相同的核酸序列，或其功能片段。

8.根据权利要求6所述的植物，其中所述组成型启动子选自下组：CaMV 35S启动子、肌动蛋白启动子、Rab15启动子和泛素启动子。

9.根据权利要求1所述的植物，其中所述经指导的核酸酶和所述至少一种指导RNA在花细胞中形成核糖核蛋白。

10.根据权利要求1所述的植物，其中所述植物选自下组：玉米植物、水稻植物、高粱植物、小麦植物、苜蓿植物、大麦植物、小米植物、黑麦植物、甘蔗植物、棉花植物、大豆植物、油菜植物、番茄植物、洋葱植物和马铃薯植物。

11.由权利要求1的植物产生的种子，其中与来自缺少所述第一核酸序列或第二核酸序列的相同品种的对照植物的种子相比，所述种子在包含所述靶序列的目标基因中包含至少一个突变。

12.一种编辑植物基因组的方法，其包括：

13.一种编辑植物细胞基因组的方法，其包括：

14.一种编辑植物基因组的方法，其包括：

15.一种在植物中产生定点整合的方法，其包括：

16.一种在植物中产生定点整合的方法，其包括：

17.一种编辑植物细胞基因组的方法，其包括：

18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述经指导的核酸酶选自下组：Cas12a、和CasX。

19.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子选自下组：A基因启动子、B基因启动子、C基因启动子、D基因启动子和E基因启动子，或其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子选自下组：AP1启动子、AP2启动子、ZAP1启动子、AP3启动子、PI启动子、ZMM16启动子、ZMM18启动子、AG启动子、ZAG1启动子、ZMM2启动子、ZMM23启动子、AGL11/STK启动子、AGL1/SHP1启动子、AGL5/SHP2启动子、ZAG2启动子、ZMM1启动子、SEP1启动子、SEP2启动子、SEP3启动子、SEP4启动子、ZAG3启动子和ZMM7/SEP样启动子，其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子包含与选自SEQ ID NO:1-30或选自SEQ ID NO...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

1.植物，其包含：

2.根据权利要求1所述的植物，其中所述经指导的核酸酶选自下组：cas12a、和casx。

3.根据权利要求2所述的植物，其中所述第一核酸序列包含与seq id no:32或seq idno:36至少90％相同的核酸序列。

4.根据权利要求1所述的植物，其中所述花细胞优选启动子是花细胞特异性启动子或其中所述花组织优选启动子是花组织特异性启动子。

5.根据权利要求1所述的植物，其中所述花细胞优选启动子选自下组：a基因启动子、b基因启动子、c基因启动子、d基因启动子和e基因启动子，或其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子选自下组：ap1启动子、ap2启动子、zap1启动子、ap3启动子、pi启动子、zmm16启动子、zmm18启动子、ag启动子、zag1启动子、zmm2启动子、zmm23启动子、agl11/stk启动子、agl1/shp1启动子、agl5/shp2启动子、zag2启动子、zmm1启动子、sep1启动子、sep2启动子、sep3启动子、sep4启动子、zag3启动子和zmm7/sep样启动子，或其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子包含与选自seq id no:1-30或选自seq id no:1-16、18-19、21-30、45-49的核酸序列至少90％相同的核酸序列，或其功能片段。

6.根据权利要求1所述的植物，其中所述第一或第二启动子选自下组：组织优选启动子、组织特异性启动子、诱导型启动子和组成型启动子，或其中所述第一或第二启动子是花细胞优选启动子或花组织优选启动子。

7.根据权利要求1所述的植物，其中所述第一或第二启动子选自下组：a基因启动子、b基因启动子、c基因启动子、d基因启动子和e基因启动子，或其中所述第一或第二启动子选自下组：ap1启动子、ap2启动子、zap1启动子、ap3启动子、pi启动子、zmm16启动子、zmm18启动子、ag启动子、zag1启动子、zmm2启动子、zmm23启动子、agl11/stk启动子、agl1/shp1启动子、agl5/shp2启动子、zag2启动子、zmm1启动子、sep1启动子、sep2启动子、sep3启动子、sep4启动子、zag3启动子和zmm7/sep样启动子，或其中所述第一或第二启动子包含与选自seq id no:1-30或选自seq id no:1-16、18-19、21-30、45-49的核酸序列至少90％相同的核酸序列，或其功能片段。

8.根据权利要求6所述的植物，其中所述组成型启动子选自下组：camv 35s启动子、肌动蛋白启动子、rab15启动子和泛素启动子。

9.根据权利要求1所述的植物，其中所述经指导的核酸酶和所述至少一种指导rna在花细胞中形成核糖核蛋白。

10.根据权利要求1所述的植物，其中所述植物选自下组：玉米植物、水稻植物、高粱植物、小麦植物、苜蓿植物、大麦植物、小米植物、黑麦植物、甘蔗植物、棉花植物、大豆植物、油菜植物、番茄植物、洋葱植物和马铃薯植物。

11.由权利要求1的植物产生的种子，其中与来自缺少所述第一核酸序列或第二核酸序列的相同品种的对照植物的种子相比，所述种子在包含所述靶序列的目标基因中包含至少一个突变。

12.一种编辑植物基因组的方法，其包括：

13.一种编辑植物细胞基因组的方法，其包括：

14.一种编辑植物基因组的方法，其包括：

15.一种在植物中产生定点整合的方法，其包括：

16.一种在植物中产生定点整合的方法，其包括：

17.一种编辑植物细胞基因组的方法，其包括：

18.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述经指导的核酸酶选自下组：cas12a、和casx。

19.根据权利要求12-17中任一项所述的方法，其中所述花细胞优选启动子或花组织优选启动子选自下组：a基因启动子、b基因启动子、c基因启动子、d基因启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：M·鲍尔，B·D·布劳尔托兰德，戴顺洪，B·奥布莱恩，T·L·斯勒温斯基，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：

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