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HPLC fingerprint identification of Lonicera Japonica Flos and Lonicera Flos

来源：花匠小妙招时间：2025-01-02 12:52

摘要:目的建立金银花的HPLC对照指纹图谱，并在相同色谱条件下测定山银花的HPLC指纹图谱，通过计算相似度来区分山银花与金银花。方法色谱柱Phenomenex Luna 5 μm C18（2）100 A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温40℃，以乙腈-0.5%磷酸溶液为流动相梯度洗脱，体积流量1 mL/min，检测波长为350 nm，相似度计算采取屏蔽大峰积分的方法。结果建立了金银花的HPLC对照指纹图谱，12批金银花相似度均在0.95以上，山银花相似度均小于0.80。结论350 nm下金银花的HPLC指纹图谱能有效区分金银花与山银花药材，屏蔽大峰积分的相似度评价方法比较准确地反映了金银花与山银花间化学成分的差异。

Abstract:ObjectiveTo compare the differences between Lonicera Japonica Flos and Lonicera Flos by establishing HPLC fingerprint and calculating the similarity.MethodsThe columns was Phenomenex Luna 5 μm C18 (2) 100A, 250 mm×4.6 mm; The column temperature was 40℃. The mobile phase was acetonitrile-0.5% phosphoric acid, the flow rate was 1 mL/min, and the wavelength was 350 nm.ResultsHPLC fingerprint of Lonicera Japonica and similarity evaluation by screening large peak integration were established. The similarity of 12 batches of Lonicera Japonica Flos were all above 0.95, and four batches of Lonicera Flos were less than 0.80.ConclusionHPLC fingerprint profiles under 350 nm can reflex the differences between Lonicera Japonica Flos and Lonicera Flos effectively; Similarity evaluation by screening large peak integration shows the tiny differences of chemical component.

Key words:Lonicera Japonica Flos Lonicera Flos HPLC-fingerprint profiles screening large peak integration similarity evaluation

金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.干燥的花蕾或者初开的花，能清热解毒、疏风散热，并表现出抗菌消炎、抗病毒、抗氧化等药理活性[1]。常用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、瘟病发热，有中药中的抗生素之称。金银花以山东平邑、河南封丘县为金银花的主产区[2]。忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.、华南忍冬Lonicera confusaDC. 或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu et S. C. Cheng的干燥花蕾或带初开的花为山银花，山银花是最常见的金银花的民间习用品种，具有与金银花相似的药理特性，主要产于湖南、湖北、广东、贵州等地。但是山银花中含有大量皂苷类成分[3]，如用于生产中药注射剂，则可能存在溶血等安全隐患。

通过指纹图谱法和定量测定鉴别金银花与山银花的文献报道也有不少[4-6]，但这些文献中山银花与金银花评价相似度差别较小，不能有效区分二者。本实验建立的金银花HPLC指纹图谱，通过对提取方法及检测波长的选择，以及相似度计算方法的优选，评价金银花和山银花的相似度存在明显差异，为准确、快速地鉴别金银花与山银花提供了科学依据。

1 仪器与试药1.1 仪器

Waters2695高效液相色谱仪-Waters996二极管阵列检测器，Precisa XR 205SM-DR分析天平；上海跃进数显式电热恒温水浴锅。

1.2 试剂及试药

甲醇、乙腈为色谱纯（Merck公司）；磷酸为分析纯；水为去离子水；对照品绿原酸（批号110753-200413）、木犀草苷（批号111720-200905）均购于中国食品药品检定研究院。

金银花样品经河南省食品药品检验所中药标本室雷留成副主任药师鉴定，J1～J12号药材均为忍冬Lonicera japonica Thunb.。J13～J16号均为山银花Lonicerae Flos，其中J13、J14号为灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand. -Mazz.，J15、J16号为红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.。见表 1。

表 1 样品信息 Table 1 Information of samples

2 方法与结果2.1 色谱条件

色谱柱Phenomenex Luna C18（2）100 A（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.5%磷酸溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，7% A；5～20 min，7%～14% A；20～35 min，14%～18% A；35～49 min，18%～60% A）；检测波长为350 nm；柱温为40 ℃；体积流量为1 mL/min。理论板数按绿原酸峰计算不低于10 000。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取绿原酸与木樨草苷适量，加甲醇制成含绿原酸和木樨草苷均为30 μg/mL的溶液，即得。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流2 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察2.4.1 精密度试验

取同一供试品溶液（样品编号J1），连续进样5次，分别对各共有峰的保留时间和峰面积进行考察，结果11个共有峰的保留时间的RSD小于0.5%，峰面积RSD小于1.5%，表明仪器精密度良好。

2.4.2 重复性试验

取同一批样品（样品编号J1）2 g，精密称定5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样测定，分别对各共有峰的保留时间和峰面积进行考察，结果11个共有峰的保留时间的RSD小于0.5%，峰面积RSD小于3%，表明该方法重复性良好。

2.4.3 稳定性考察

取同一供试品溶液（样品编号J1），分别在0、3、6、12、15 h进样测定，分别对各共有峰的保留时间和峰面积进行考察，结果11个共有峰的保留时间的RSD小于0.5%，峰面积RSD小于3%，表明供试品溶液在15 h内基本稳定。

2.5 结果与分析2.5.1 金银花HPLC指纹图谱

取12批金银花样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，并按照“2.1”项下的色谱条件进样，记录49 min内各溶液的色谱图，12张图谱中，以绿原酸和木犀草苷为对照，在10～49 min内共有11个共有峰。经过各对照品保留时间定位及光谱确认，1、2、5、7、10、11号峰依次为新绿原酸、绿原酸、芦丁、木犀草苷、异绿原酸A及异绿原酸C，见图 1。

2-绿原酸 7-木犀草苷2-chlorogenic acid 7-luteoloside图 1 对照品 (A) 和金银花样品 (B) 的HPLC图Fig.1 HPLC of standard substance (A) and L. japonica sample (B)

2.5.2 金银花指纹图谱相似度评价结果

采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件2004A版》对12张图谱进行数据处理，屏蔽2个最大的色谱峰绿原酸及异绿原酸A，使之不参与积分，其余9个共有峰多点校正，对照图谱生成方法为中位数法，时间窗宽度0.1 min，自动匹配，计算12批金银花样品的相似度系数，12批金银花样品与生成的对照指纹图谱相似度均在0.95以上，见图 2和表 2。

图 2 金银花HPLC指纹图谱叠加图Fig.2 HPLC fingerprints of L. japonica samples

表 2 12批金银花HPLC指纹图谱与对照指纹图谱相似度 Table 2 Similarities of HPLC fingerprints of L. japonica

2.5.3 山银花指纹图谱相似度评价结果

取4批山银花样品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，以绿原酸和木犀草苷为对照品，并按照“2.1”项下的色谱条件进样，记录49 min内各溶液的色谱图，以生成的金银花对照指纹图谱为对照，屏蔽绿原酸及异绿原酸A积分，多点校正，自动匹配，进行相似度评价，计算4批山银花的相似度，结果4批山银花的相似度均小于0.80，与金银花指纹图谱差异明显，见图 3、4和表 3。

2-绿原酸 7-木犀草苷2-chlorogenic acid 7-luteoloside图 3 对照品 (A) 和山银花样品 (B) 的HPLC图Fig.3 HPLC of reference substance (A) and Lonicerae Flos samples (B)

图 4 山银花指纹图谱叠加图Fig.4 HPLC fingerprints of Lonicerae Flos

表 3 4批山银花HPLC指纹图谱相似度 Table 3 Similarities of HPLC fingerprints of Lonicerae Flos samples

3 讨论3.1 关于样品的收集

虽然学术上有金银花与山银花之分，但在市场上，常常皆作金银花出售。收集样品的过程中，笔者发现，河南、河北及山东等北方几省所售金银花多为正品金银花，而湖南、湖北等南方城市所售金银花有混淆山银花的情况，而这种掺有混淆品的样品，实验前都进行了细致的鉴别分类，以便实验使用。因此虽然灰毡毛忍冬和红腺忍冬样品各只有2批，却是经过多批样品鉴别分类的结果，也具有较强的代表性。

3.2 提取溶剂及提取方法的考察

比较了超声与回流2种方法分别在水、50%甲醇溶液、甲醇3种溶剂的条件下对金银花药材化学成分的提取效果，结果表明在溶剂选用纯甲醇用回流法提取的情况下，提取效果较好，故采用纯甲醇做提取溶剂，采用回流的方法提取。

3.3 色谱柱的选择

在相同的色谱条件下，考察了CAPCELL PAK C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent ZORBAX SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Phenomenex Luna 5μm C18（2）100 A（250 mm×4.6 mm，5 μm）3个不同品牌的色谱柱，以Phenomenex Luna 5μm C18（2）100 A（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱所得到的色谱图峰形最好，峰数最多。

3.4 检测波长的确定

在相同的色谱条件下，通过全波长扫描筛查，重点考察了350 nm和238 nm 2个检测波长。350 nm与238 nm条件下的所得的色谱峰峰形均较好，238 nm条件下的色谱峰较多，但350 nm下小面积色谱峰峰形和分离效果更好。但238 nm条件下12批金银花之间的相似度差异较大，在0.27～0.99，说明238 nm检测波长下不同产地及批次的金银花检出的化学成分不稳定。而350 nm检测波长下所得12批金银花色谱图相似度均在0.95以上，能够较稳定地反映不同产地金银花的共性特征，因此选用350 nm作为检测波长。

3.5 相似度计算方法的考察

由于金银花与山银花中均含有绿原酸和异绿原酸A，且这2种成分量较高，在相似度计算时，权重较大，但指纹图谱间的细微差异可能才是质量评价的关键[7]。在绿原酸与异绿原酸A 2个大峰参与积分的条件下，金银花与山银花HPLC指纹图谱的相似度均在0.9以上，无明显差异；而在绿原酸与异绿原酸A 2个大峰不参与积分的条件下，金银花与山银花相似度差异较大，能达到很好的鉴别效果。因此，在金银花对照指纹图谱中，绿原酸及异绿原酸A作为特征峰必须存在，但在相似度计算中，可以通过屏蔽2峰积分的方法，更好地体现金银花与山银花之间微量化学成分的差异。而这种屏蔽强峰的相似度评价方法对于化学成分差异细微的药材有更好的鉴别意义。