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一种柑橘脱毒及微芽嫁接的快速繁殖方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2025-01-01 22:17

本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种柑橘脱毒及微芽嫁接的快速繁殖方法。

背景技术：

柑橘(citrusretioulatablanco)是一种极其重要的果树，在全球热带、亚热带地区均有种植，其种植面积和总产量在水果中居第一位。中国是柑橘重要的原产地之一，柑橘种质资源丰富，优良品种繁多。柑橘是我国种植面积和产量最大的果树之一，2016年柑橘全国总种植面积3841.2万亩，总产量达3764.9万吨。柑橘产业已成为我国水果乃至农业的支持产业，对果农增收、农民就业、生态环境等产生显著影响，发展柑橘产业具有良好的经济效益、社会效益和生态效益。

然而，由于长期的分散经营，种植是以小规模的个体农户为主，导致柑橘产业存在较多的问题，特别是柑橘良种繁育体系不健全，缺乏科学的良种良法和育繁推一体化机制，苗木市场极不规范，由此，导致柑橘黄龙病蔓延十分严重。在我国柑橘主产区，较多区域的黄龙病发病率达30-50％，个别区域已高达80％以上，直接经济损失惊人。柑橘黄龙病已成为制约我国柑橘产业可持续健康发展的最大因素，亟需解决。

但是，到目前为止，利用柑橘脱毒微芽嫁接的快繁方法，国内尚属首例。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种能在短时间内获得大量脱毒柑橘嫁接苗的柑橘脱毒及微芽嫁接的快速繁殖方法。

本发明的柑橘脱毒及微芽嫁接的快速繁殖方法，包括以下步骤：

s1、柑橘不定芽的诱导：选取柑橘的幼嫩枝条作为外植体，将外植体进行消毒处理后接种于诱导培养基上培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50～80μmolm-2s-1，光照时间8～10h/d，直至诱导出不定芽；所述的诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg和/或6-糠基氨基嘌呤0.1mg，吲哚-3-丁酸0.1～0.2mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9；

s2、继代增殖：将诱导出的不定芽转到增殖培养基进行继代培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50～80μmolm-2s-1，光照时间8～10h/d，继代增殖得到的不定芽能用于柑橘的微芽嫁接或者继续继代增殖；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤2.0～3.0mg和吲哚-3-丁酸0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9；

s3、砧木的无菌播种：将砧木种子进行消毒处理后，接入萌发培养基中培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50～60μmolm-2s-1，光照时间9h/d，获得砧木无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸1.0～3.0mg和α-萘乙酸0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9；

s4、柑橘的微芽嫁接：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在砧木无菌苗上进行嫁接后转入稳定培养基中培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50～80μmolm-2s-1，光照时间8～10h/d，获得试管苗；稳定培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸0.1～0.2mg，吲哚-3-丁酸2.0～3.0mg和赤霉素0.1～0.2mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9；

s5、试管苗移栽：将试管苗移植到栽培基质中，置于湿润、遮荫的环境下培养，浇水，施肥以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，获得栽培苗。

优选，所述的选取柑橘的幼嫩枝条作为外植体，将外植体进行消毒处理后接种于诱导培养基上培养具体为：选取柑橘的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养。

优选，所述的选取柑橘的幼嫩枝条作为外植体，将外植体进行消毒处理后接种于诱导培养基上培养具体为：选取柑橘的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后将其置于冰箱48h后再用质量分数为0.1％升汞水溶液浸泡2min，无菌水冲洗3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养。

优选，所述的将砧木种子进行消毒处理是将砧木种子用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次。

优选，所述的以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在砧木无菌苗上进行嫁接后转入稳定培养基中培养具体为：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在培养得到的砧木无菌苗的三分之一处切除顶端部分，然后在茎段纵切，切面保持光洁，在带有叶原基的接穗上切取0.7mm微芽植入砧木切口处，使微芽与砧木切口紧密结合，然后转入稳定培养基中培养。

所述的栽培基质优选为泥炭土、椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为3:2:2:1混合的混合基质；或者优选为珍珠岩；或者优选为椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为2:2:1混合的混合基质；或者优选为泥炭土和珍珠岩按体积比为1:3混合的混合基质。

所述的移栽培养是将嫁接所得的完整植株，移栽至栽培基质中培养，置于湿润遮荫(相对湿度为30～50％、透光率为40～50％)、20～25℃的环境下培养，每星期施用1wt‰的复合肥一次，以满足试管苗生长所需的水分和营养，获得栽培苗；所述复合肥中n:p:k的质量比为1:1:1。

本发明中的mt培养基为国际通用的培养基，其成分和配制方法可参看谭文澄、戴策刚主编，《观赏植物组织培养技术》，北京：中国林业出版社，1991。

由于柑橘的枝条木质化较为严重，我们将其按部位划分，把外植体类型分为顶芽、中段腋芽、下段腋芽。经过试验得知，顶芽外植体萌发较早，但易掉落；中段腋芽萌发初期生长正常，但培养一段时间后也会出现萌芽掉落现象；下段腋芽经灭菌后，萌发较慢，但萌发的新芽生长旺盛，未出现萌芽掉落现象。从而筛选出较为理想的外植体材料。

由于柑橘的微芽嫁接苗较小，一般不超过3cm，在移植到室外后很容易失水或养分缺乏而死亡。因此本发明将嫁接苗移栽至混合基质(混合基质为泥炭土、椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为3:2:2:1混合的混合基质；或者为珍珠岩；或者为椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为2:2:1混合的混合基质；或者为泥炭土和珍珠岩按体积比为1:3混合的混合基质)中，置于湿润、荫蔽的环境下培养，浇水，施肥以满足组培苗生长所需的水分和营养需要，保证嫁接苗有较高的成活率。

我们开展柑橘脱毒快繁及其试管内微芽嫁接的试验研究工作，以红江橙、沙糖桔两个广东特色柑橘品种为研究开发对象，对外植体选择处理和检测，不定芽诱导与继代增殖，砧木种子无菌播种，微芽嫁接等进行了系统的研究，形成了一套柑橘脱毒快繁与微芽嫁接成苗的生产技术体系。

与现有的技术相比，本发明具有以下优点：

本发明从外植体的诱导、砧木的无菌播种到获得嫁接苗整个实验过程，创新性的利用诱导出的柑橘不定芽作为接穗，在砧木的无菌苗上进行嫁接，从而获得嫁接苗，经移栽后，其成活率高达93％以上，从而能够获得大量的无毒柑橘嫁接苗，使柑橘产业能够可持续健康发展。

本发明方法操作简单，易于实施，所用的培养基和试剂易配置，成本低，易大范围推广。

附图说明：

图1为实验例1中的柑橘脱毒快繁及嫁接照片；其中：a：柑橘枝条下段腋芽在诱导培养基上培养30d左右，诱导出的不定芽；b：不定芽在增殖培养基上培养30d左右；c：在萌发培养基上的砧木无菌播种，15d左右获得无菌苗；d：微芽嫁接；e：在稳定培养基中的完整嫁接植株。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

实施例1：

s1、柑橘不定芽的诱导：以从华南农业大学园艺学院试验场采集的砂糖桔的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间8h/d的条件下培养28d诱导出不定芽(见图1a)；诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg、吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg和6-糠基氨基嘌呤(kt)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s2、继代增殖：将诱导出的不定芽转到增殖培养基进行继代培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间8h/d，一个月为一个继代周期，每个继代周期增殖2.4倍(见图1b)；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s3、砧木的无菌播种：将从华南农业大学园艺学院采集的红黎檬种子用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后接入萌发培养基中培养，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间9h/d，15d后萌发，培养获得无菌苗(见图1c)；萌发培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)2.0mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s4、柑橘的微芽嫁接：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在培养得到的砧木无菌苗的三分之一处切除顶端部分，然后在茎段纵切，切面保持光洁。在带有叶原基的接穗上切取0.7mm微芽植入砧木切口处，使微芽与砧木切口紧密结合(见图1d)，然后转入稳定培养基中，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间8h/d，30d后长成试管苗(见图1e)；稳定培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸(naa)0.2mg、吲哚-3-丁酸(iba)2.0mg和赤霉素(ga3)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s5、试管苗移栽：将试管苗移植到泥炭土、椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为3:2:2:1混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为30～50％、透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(复合肥中n：p：k的质量比为1：1：1)一次)，以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后试管苗长到4～5cm高，获得栽培苗，成活率高达93％。

实施例2：

s1、柑橘不定芽的诱导：以从华南农业大学园艺学院试验场采集的砂糖桔的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后将其置于冰箱48h后再用质量分数为0.1％的升汞水溶液浸泡2min，无菌水冲洗3次。最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为26～28℃，光照强度为60μmolm-2s-1，光照时间9h/d的条件下培养27d诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg、吲哚-3-丁酸(iba)0.2mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s2、继代增殖：将不定芽转到增殖培养基进行继代培养，培养条件为26～28℃，光照强度为60μmolm-2s-1，光照时间9h/d，一个月为一个继代周期，每个继代周期增殖2.9倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s3、砧木的无菌播种：将从华南农业大学园艺学院采集的红黎檬种子用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后接入萌发培养基，培养条件为26～28℃，光照强度为60μmolm-2s-1，光照9h/d，15d后萌发，培养获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)1.0mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s4、柑橘的微芽嫁接：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在培养得到的砧木无菌苗的三分之一处切除顶端部分，然后在茎段纵切，切面保持光洁。在带有叶原基的接穗上切取0.7mm微芽植入砧木切口处，使微芽与砧木切口紧密结合，然后转入稳定培养基中，培养条件为26～28℃，光照强度为60μmolm-2s-1，光照时间9h/d，30d后长成试管苗；稳定培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸(naa)0.2mg、吲哚-3-丁酸(iba)3.0mg和赤霉素(ga3)0.2mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s5、试管苗移栽：将试管苗移植到珍珠岩基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为30～50％、透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(复合肥中n：p：k的质量比为1：1：1)一次)，以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后试管苗长到4～5cm高，获得栽培苗，成活率高达93％。

实施例3：

s1、柑橘不定芽的诱导：以从华南农业大学园艺学院试验场采集的砂糖桔的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为26～28℃，光照强度为80μmolm-2s-1，光照时间8h/d的条件下培养28d诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg、吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg和6-糠基氨基嘌呤(kt)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s2、继代增殖：将不定芽转到增殖培养基进行继代培养，培养条件为26～28℃，光照强度为80μmolm-2s-1，光照时间8h/d，一个月为一个继代周期，每个继代周期增殖2.4倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)2.0mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s3、砧木的无菌播种：将从华南农业大学园艺学院采集的红黎檬种子用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后接入萌发培养基，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间9h/d，15d后萌发，培养获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)2.0mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s4、柑橘的微芽嫁接：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在培养得到的砧木无菌苗的三分之一处切除顶端部分，然后在茎段纵切，切面保持光洁。在带有叶原基的接穗上切取0.7mm微芽植入砧木切口处，使微芽与砧木切口紧密结合，然后转入稳定培养基中，培养条件为26～28℃，光照强度为80μmolm-2s-1，光照时间8h/d，30d后长成试管苗；稳定培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸(naa)0.1mg、吲哚-3-丁酸(iba)3.0mg和赤霉素(ga3)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s5、试管苗移栽：将试管苗移植到椰糠、珍珠岩和河沙按体积比为2:2:1混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为30～50％、透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(复合肥中n：p：k的质量比为1：1：1)一次)，以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后试管苗长到4～5cm高，获得栽培苗，成活率高达93％。

实施例4：

s1、柑橘不定芽的诱导：以从华南农业大学园艺学院试验场采集的砂糖桔的幼嫩枝条作为外植体，将枝条下段含腋芽部分用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，最后将茎段切成1cm大小，接种于诱导培养基上培养，培养条件为26～28℃，光照强度为65μmolm-2s-1，光照时间10h/d的条件下培养30d诱导出不定芽；诱导培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg、吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg和6-糠基氨基嘌呤(kt)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s2、继代增殖：将不定芽转到增殖培养基进行继代培养，培养条件为26～28℃，光照强度为65μmolm-2s-1，光照时间10h/d，一个月为一个继代周期，每个继代周期增殖2.4倍；增殖培养基为：每升培养基中含有6-苄氨基嘌呤(bap)3.0mg和吲哚-3-丁酸(iba)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s3、砧木的无菌播种：将从华南农业大学园艺学院采集的红黎檬种子用自来水清洗干净后，先以体积分数为75％酒精水溶液表面擦洗消毒10s，无菌水洗涤2次，之后在质量分数为0.1％升汞水溶液中浸泡8min，并以无菌水洗涤3次，然后接入萌发培养基，培养条件为26～28℃，光照强度为50μmolm-2s-1，光照时间9h/d，15d后萌发，培养获得无菌苗；萌发培养基为：每升培养基中含有吲哚-3-丁酸(iba)3.0mg和α-萘乙酸(naa)0.1mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s4、柑橘的微芽嫁接：以步骤s2诱导出的不定芽作为接穗，在培养得到的砧木无菌苗的三分之一处切除顶端部分，然后在茎段纵切，切面保持光洁。在带有叶原基的接穗上切取0.7mm微芽植入砧木切口处，使微芽与砧木切口紧密结合，然后转入稳定培养基中，培养条件为26～28℃，光照强度为65μmolm-2s-1，光照时间10h/d，30d后长成试管苗；稳定培养基为：每升培养基中含有α-萘乙酸(naa)0.2mg、吲哚-3-丁酸(iba)3.0mg和赤霉素(ga3)0.2mg，其余成份为mt培养基，ph为5.9。

s5、试管苗移栽：将试管苗移植到泥炭土和珍珠岩按体积比为1:3混合的混合基质中，置于湿润、遮荫(相对湿度为30～50％、透光率为40～50％)的环境下培养，室外温度介于20～25℃，经浇水，施肥(每星期施用1‰的复合肥(复合肥中n：p：k的质量比为1：1：1)一次)，以满足试管苗生长所需的水分和营养需要，经常规培养，一个月后试管苗长到4～5cm高，获得栽培苗，成活率高达93％。