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一种裸花紫珠脱毒微繁方法

来源：花匠小妙招时间：2024-12-17 09:20

一种裸花紫珠脱毒微繁方法
【专利摘要】本发明提供一种裸花紫珠脱毒微繁方法，涉及利用植物脱毒微繁殖及组织培养的方法，解决裸花紫珠繁殖周期长、增殖效率低和成本高的问题。方法：①外植体消毒；②无菌苗培养；③微枝培养，将增生的无菌苗转接于壮苗培养基中培养；④增殖培养，将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或1～2个腋芽进行培养；⑤生根培养，待微枝生长长度为2.0～3.0cm，转接于生根培养基中；⑥炼苗培养，将生根培养的裸花紫珠苗于荫棚炼苗7～10d；⑦将经过炼苗后裸花紫珠苗移栽于育苗杯，即完成裸花紫珠的脱毒微繁。本发明中裸花紫珠的脱毒微繁方法，具有繁殖周期短，增殖率高、苗木性状一致、成本低、生根率和移苗成活率高、生长周期不受季节限制等优点。
【专利说明】一种裸花紫珠脱毒微繁方法

【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种裸花紫珠的组培快速繁殖的技术，本发明属于种子种苗、农业生物技术和药用植物栽培领域。
[0002]

【背景技术】
[0003] H繁HCallecarpa. nudiflora Hook, et Arn)为马鞭草科紫珠属植物，以其干燥叶片入药，收载于《中国药典》1977年版。具有止血散瘀、抗菌消炎之功效，是裸花紫珠片、裸花紫珠分散片、裸花紫珠胶囊、裸花紫珠颗粒、裸花紫珠栓等近40余种中成药的重要原料。由于裸花紫珠为重要的医药原料，野生资源破坏严重，采集野生资源已经不能满足生产需要，开展规范化生产是解决药材短缺的有效途径，而种苗繁育是规范化生产的重要组成部分，由于裸花紫珠果实成熟周期较长，种子成熟度不一，加上种子狭小，种皮坚硬，于是裸花紫珠种苗繁育周期较长，出苗不一致，远远不能满足市场的需要，这使裸花紫珠在我国境内的推广栽培和资源利用受到了极大的限制。
[0004] 利用植物组织培养技术建立裸花紫珠脱毒微繁体系是生产优质裸花紫珠优质种苗的有效途径，其关键技术之一在于脱毒方法的建立、微枝培养、增殖培养和生根培养，不同激素组合及其浓度对此影响很大。CN102870678A公开了一种组织培养快速繁殖裸花紫珠的方法，通过利用扦插繁殖的裸花紫珠的新枝为外植体，进行接种培养、扩繁培养、生根培养、炼苗移栽。国内外尚未见到裸花紫珠果实外植体的组织培养、脱毒微繁等研究的报道，本专利通过对脱毒方法的建立、微枝培养、增殖培养和生根培养，建立了裸花紫珠种子外植体的脱毒微繁方法，为裸花紫珠种苗的工业化生产的奠定了基础。
[0005]

【发明内容】

[0006] 本发明的目的是为了解决裸花紫珠繁殖周期长、增殖效率低、成本高和遗传稳定性差的问题，而提供的一种低成本、稳定一致、增殖效率高的裸花紫珠脱毒微繁方法。
[0007] 裸花紫珠的脱毒微繁方法按以下步骤实现：①外植体消毒，将清洗后的裸花紫珠果实外植体在超净工作台上用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡30?60s后，然后用无菌水冲洗3?5次，再用质量浓度为0. 1%的氯化汞溶液消毒12?15min，然后用无菌水冲洗3?5次；②无菌苗培养，将种子从消毒后的果实外植体中剥离出，接种于以改良MS固体培养基为基本培养基，且还包含0. Of 0. 03mg/L的赤霉素、0. Of 0. 03 mg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0的诱导培养基，然后在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80?100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至无菌芽长度为0. 5?I. 0 cm ;③微枝培养，将增生的无菌芽一起转接于以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为0. 5?1. 0%的有机附加物，质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为 5. 6?6. 0的壮苗培养基中，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为50?70 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至无菌芽生长长度为15. O?20. O cm,即为微枝；④增殖培养，将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或1?2个腋芽、且长度为I. 0?2. 0 cm的茎段然后接种于以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含0. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08? 0. I mg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0的增殖培养基，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80?100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养，视种苗需求数量可增殖25?30d ;⑤生根培养，待微枝生长长度为2. 0?3. 0 cm，转接于以改良MS固体培养基为基本培养基且还含0. 1%?1. 0%活性炭或0. 05?0. I mg/L的 NAA和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0的生根培养基中进行生根培养，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80?100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至裸花紫珠微枝根的生长长度为1. 5?2. 0 cm ;⑥炼苗培养，将生根培养的裸花紫珠苗于隐蔽度为15%?20%的荫棚，炼苗7?10 d ;⑦将经过炼苗后裸花紫珠苗移栽于含 10%?15%蛭石，10%?15%牛粪，10%?15%椰糠和55%?70%腐殖土的育苗杯，即完成裸花紫珠的脱毒微繁。
[0008] 上述方案中，所述的改良MS固体培养基由1/2MS培养基，增加75. (Γ100. 0 mg/L 的肌醇制得。
[0009] 作为本发明的优选方案，本发明中步骤②无菌苗培养为：将消毒后的裸花紫珠种子接种于以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含0. 01mg/L的赤霉素、0. 01 mg/L的NAA 和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0的诱导培养基。
[0010] 作为本发明的优选方案，本发明中步骤③中，所述壮苗培养基中有机附加物为椰子乳、土豆泥、胡萝卜泥中的一种或多种，进一步优选方案为有机附加物为质量浓度为0. 5% 的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡萝卜泥。
[0011] 作为本发明的优选方案，本发明中步骤④增殖培养中，所述的增殖培养基中6-BA 浓度为〇· 5mg/L，NAA 浓度为 0· 10mg/L。
[0012] 以下通过如下实验详细描述本发明的技术方案：实验材料本发明中实验所用的裸花紫珠种子为2011年12月份?2012年1月份在海南省儋州、五指山、白沙、海口等市县采收的白色成熟的裸花紫珠 WJicarjDa /W￡/i/7ora Hook. Et Arn)果实为实验材料。
[0013] 本发明中所用培养基均含质量浓度为2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0。
[0014] 实验一：裸花紫珠外植体消毒一、实验方法将裸花紫珠种子分为6组，用75%酒精30?60s和升汞消毒7?15min，无菌水漂洗5 次至pH=7,重复3次，置于30°C恒温培养箱全光照培养，于10?12d后统计污染率与增殖率。
[0015] 本实验中污染率是指接种IOd后被细菌或真菌污染的外植体瓶数占总接种瓶数的百分率；褐化率是指接种IOd后外植体褐化变黑的瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖率是指接种IOd后外植体开展生长的瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖系数是指接种30d后，与原接种量相比，增殖的倍数百分率。
[0016] 二、实验结果如表1所示，（1)控制升汞消毒时间为lOmin，考察75%酒精消毒时间对消毒效果的影响，结果表明：当升汞消毒时间为10min，30s、45s和60s的酒精消毒对裸花紫珠果实的消毒效果影响不大，其污染率23±3%，增殖率为77%±3% ; (2)控制酒精消毒时间为30s和60 s，考察〇. 1%升汞消毒时间对消毒效果的影响，结果表明：消毒效果随升汞消毒时间的递增而愈好，其中控制酒精消毒时间为30s，0. 1%升汞消毒时间为12min，其污染率12±2%，增殖率为88%±2% ;酒精消毒时间为30s，0. 1%升汞消毒时间为15min，其污染率10±2%，增殖率为 90%±2%。所以从本研究得出以下结论：（1)裸花紫珠果实的最佳消毒程序为75%酒精消毒 3(T60s，0. 1%升汞消毒时间为12mirTl5 min，其污染率在10%，增殖率为90%。
[0017] 表1 消毒时间对消毒效果的影响

【权利要求】
1. 一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于裸花紫珠的脱毒微繁方法按以下步骤实现：①外植体消毒，将清洗后的裸花紫珠果实外植体在超净工作台上用质量浓度为75%的乙醇溶液浸泡3(T60s后，然后用无菌水冲洗3?5次，再用质量浓度为0. 1%的氯化汞溶液消毒12?15min，然后用无菌水冲洗3?5次；②无菌苗培养，将种子从消毒的裸花紫珠果实中剥离出，接种于诱导培养基，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80? 100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至无菌芽长度为0.5?1.0 cm;③微枝培养，将增生的无菌芽一起转接于壮苗培养基中，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为 50?70 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至无菌芽生长长度为15. 0?20. 0 cm,即为微枝；④增殖培养，将增壮后的微枝切割成带有1个顶芽或1?2个腋芽、且长度为1. 0?2. 0 cm的茎段然后接种于增殖培养基，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80? 100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养，视种苗需求数量可增殖25?30d ;⑤生根培养，待微枝生长长度为2. 0?3. 0 cm，转接于生根培养基中进行生根培养，在温度为25?28°C、湿度为70%?80%、光照强度为80?100 lx、光照8?10 h/d的条件下培养至裸花紫珠微枝根的生长长度为1. 5?2. 0 cm ;⑥炼苗培养，将生根培养的裸花紫珠苗于隐蔽度为15%? 20%的荫棚，炼苗7?10 d ;⑦将经过炼苗后裸花紫珠苗移栽于含10%?15%蛭石，10%? 15%牛粪，10%?15%椰糠和55%?70% 土壤的育苗杯，即完成裸花紫珠的脱毒微繁；其中步骤②中诱导培养基是以改良MS固体培养基为基本培养基，且还包含0. 01~0. 03mg/L的赤霉素、0· 01~0· 03mg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3· 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0 ;步骤③中壮苗培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含质量浓度为0. 5?1. 0%的有机附加物，质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0 ;步骤④中增殖培养基是以改良MS 固培养基为基本培养基，且还包含〇. 5?0. 8mg/L的6-BA、0. 08?0. 1 mg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0 ;步骤⑤中生根培养基是以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含0. 1%?1. 0%的活性炭或0. 05?0. 1 mg/L的NAA和质量浓度为 2. 5?3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0。
2. 根据权利要求1所述的一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于所述的改良MS固体培养基由1/2MS培养基，增加75. (Γ100. 0 mg/L的肌醇制得。
3. 根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于步骤②中将消毒后的裸花紫珠种子接种于以改良MS固培养基为基本培养基，且还包含0. 01mg/L的赤霉素、0. 01mg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3. 0%的蔗糖，pH值为5. 6?6. 0的诱导培养基。
4. 根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于步骤③中，所述壮苗培养基中有机附加物为椰子乳、土豆泥、胡萝卜泥中的一种或多种。
5. 根据权利要求4所述的一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于步骤③中，所述壮苗培养基中有机附加物为质量浓度为〇. 5%的椰子乳或1. 5% 土豆泥或1. 5%胡萝卜泥。
6. 根据权利要求1或2所述的一种裸花紫珠的脱毒微繁方法，其特征在于步骤④增殖培养中，所述的增殖培养基中包含〇. 5mg/L的6-BA、0. lmg/L的NAA和质量浓度为2. 5~3. 0% 的鹿糖，pH值为5. 6?6. 0。
【文档编号】A01H4/00GK104221852SQ201310229432
【公开日】2014年12月24日申请日期:2013年6月9日优先权日:2013年6月9日
【发明者】张影波, 于福来, 李伟, 庞玉新, 谷陟欣, 黄胜, 徐向平, 王丹, 官玲亮, 袁莉申请人:九芝堂股份有限公司, 海南九芝堂药业有限公司