土壤棉花黄萎病菌的分子检测

土壤棉花黄萎病菌的分子检测

【摘要】： 棉花黄萎病是一种世界性的土传真菌病害,能在土壤中存活数年,连年发病,难以根治。由于土壤中棉花黄萎病菌的数量与发病程度关系密切,本研究制备了包含棉花黄萎病菌16s rDNA的保守区域的重组质粒,并以该质粒为标准品,建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR法,定量检测出土壤中棉花黄萎病菌的核酸数量。主要研究成果如下:1、综合比较各种真菌基因组DNA的提取方法,以致病力较强的陕西泾阳菌株为试验对象,采用改进的CTAB法提取棉花黄萎病菌DNA。结果显示提取样品的DNA浓度均在1500 ng/μL左右,A260/A280和A260/A230值也都表明提取的DNA质量较高。2、从陕西省泾阳县斗口棉花黄萎病病圃田中发病棉株的根围土壤采集5个带菌土样,并对带菌土样的宏基因组DNA进行提取和回收纯化,试图跳过土样中棉花黄萎病菌的分离,直接从基因水平上鉴定棉花黄萎病菌。采用CTAB-SDS-冻融法和试剂盒纯化相结合的方法,提取出了土壤基因组DNA。通过电泳和PCR检测,证明得到的土壤基因组DNA质量较高,可以用于后续的分子生物学研究。3、以棉花黄萎病菌16s rDNA上的ITS序列为研究对象,对特异性引物dllz1/dllz2扩增的目的片段进行克隆、测序,并转入到pGEM-T easy载体上。经过测序比对,表明导入到载体上的目的片段长度为342bp,与GenBank中大丽轮枝菌100%同源。制备的重组质粒作为实时荧光定量PCR反应的标准品。4、以获得的含有棉花黄萎病菌16s rDNA的保守区域的重组质粒为标准品,建立SYBR Green I实时荧光定量PCR反应的标准曲线,并对曲线的重复性、再现性和敏感性进行评价。重复性和再现性评价结果显示组内变异系数为0.72%-1.12%,组间变异系数为1.15%-2.06%,标准曲线的检测范围在3.8×10~3copies/μL -3.8×10~8copies/μL之间有良好的线性关系,相关系数R2为0.996,扩增效率为101.5%,灵敏度比常规PCR方法高102倍。并以构建的标准曲线为基准,定量检测病田土壤样本中的棉花黄萎病菌。该研究建立的实时荧光定量PCR方法可为棉花黄萎病菌的病害风险评价及制定综合防治措施提供技术支持和理论依据。同时,该方法的建立,也为土壤中其它病原菌的检测提供了理论和技术的参考。

【学位授予单位】：西北农林科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2011

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