GY3基因在控制水稻每穗颖花数和单株产量中的应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及gy3基因在控制水稻每穗颖花数和单株产量中的应用。本发明对位于水稻第3染色体长臂末端一个控制水稻每穗颖花数基因gy3进行了分离克隆、功能验证以及作为水稻骨干品种产量性状改良中的应用。

背景技术：

水稻是人类重要的粮食作物，而随着人口的增长和生活水平的提高以及城市化导致可耕种面积不断减少，对水稻产量的增长提出严苛的需求，因此，水稻产量的遗传改良一直是育种的重要目标。水稻产量主要由单株产量决定，每穗粒数、千粒重和分蘖数之积构成单株产量，同时，抽穗期的长短决定了品种的地区适应性，而适宜的株高在保证尽量高的生物量的同时抗倒伏，从而保证水稻产量的稳定。

水稻中已经克隆了众多影响产量的基因。gn1a(ashikarim等，cytokininoxidaseregulatesricegrainproduction,science,2005,309:741-745)是日本人克隆的一个影响产量的基因，编码细胞分裂素氧化酶osckx2，可以促进细胞分裂素的降解，突变后细胞分裂素得到积累从而增加产量。huang等(huangx等，naturalvariationatthedep1locusenhancesgrainyieldinrice,natgenet,2009,41:494-497)克隆了一个直立穗基因dep1，它编码一个未知的磷脂酰乙醇胺结合蛋白(pebp)，通过调控osckx2的表达来影响分生组织的活性和细胞的分裂增殖，该基因突变能促进细胞分裂，使稻穗变密、枝梗数增加、每穗籽粒数增多。zha等(zhax等，over-expressionofthericelrk1geneimprovesquantitativeyieldcomponents,plantbiotechnolj,7:611-20)克隆一个富含亮氨酸重复受体样激酶基因lrk1，lrk1是一个质膜蛋白，在幼穗中组成型表达，过表达该基因可以增加每穗颖花数。理想株型基因osspl14编码类squamosa启动子结合蛋白并受micro-rnaosmir156的调控，在营养生长期，osspl14控制水稻分蘖；在生殖生长期，osspl14的高表达促进了穗分支，研究表明osspl14的一个点突变扰乱了osmir156对osspl14的调控，osspl14突变后，使得水稻分蘖减少、穗粒数和千粒重增加，同时茎秆变得粗壮，抗倒伏能力增强，进而提高产量(jiaoy等，regulationofosspl14byosmir156definesidealplantarchitectureinrice,natgenet,42:541-544)。另外一些基因，具有多效性，例如ghd7(weiyaxue等，naturalvariationinghd7isanimportantregulatorofheadingdateandyieldpotentialinrice,natgenet,2008,40:761-767)、ghd8(wenhaoyan等，amajorqtl,ghd8,playspleiotropicrolesinregulatinggrainproductivity,plantheight,andheadingdateinrice,molplant,2011,4:319-330)、ghd7.1(wenhaoyan等，naturalvariationinghd7.1playsanimportantroleingrainyieldandadaptationinrice,cellres,2013,23:969-971)等具有增加产量和株高的作用，但是他们都需要以延长生育期为代价。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，克隆了一个控制水稻谷粒产量基因gy3(尤其是控制水稻每穗颖花数和单株产量)及其应用。这个基因在不延长抽穗期的情况下，使骨干品种显著增产，具有较好的生产应用前景。申请人将克隆的这个基因命名为gy3基因(grainyield3)。

本发明利用图位克隆的方法克隆了一个位于第3染色体长臂末端，能同时增加水稻二次枝梗、每穗颖花数和单株产量的基因，在近等基因系背景下，能增加10个二次枝梗，约50粒的每穗颖花数和约10多克的单株产量。同时，通过分析发现，粳稻携带了增产的等位基因，而籼稻只有部分携带了增产等位基因，应用这个产量基因可以改良籼稻产量。将粳稻中优良的等位基因通过连续回交的方法导入骨干品种“93-11”，“明恢63”和“特青”均具有显著的增产作用。因此gy3基因具有很强的应用价值。

本发明的技术方案如下所述：

(1)qtl扫描及近等基因系的构建：利用以水稻品种“02428”(来自江苏省农业科学院)和“特青”(tq)(广东省农业科学院黄耀祥院士选育和惠赠)杂交获得f1，利用ssr标记rm570和rm7389(引物序列参考网站http://www.gramene.org/设计)鉴定真杂种，挑选真杂种连续与02428回交4次获得bc4f1，构建流程请参考图1，种植导入系bc4f2分离群体，并进行产量相关性状的qtl扫描，在第3染色体末端检测到一个控制水稻每穗颖花数和产量的qtlqgy3(biwu等，twoquantitativetraitlociforgrainyieldandplantheightonchromosome3aretightlylinkedincouplingphaseinrice,molbreeding,2015,35:156)。为了进一步验证以及克隆qgy3，挑选bc4f2群体中编号为m43单株与轮回亲本回交并自交获得bc5f2分离群体，通过对分离群体的遗传分析，发现纯合02428等位基因型具有增产的作用，可以增加约50粒的每穗颖花数和约10多克的单株产量，即完成了gy3近等基因系的构建以及初步定位。

(2)gy3的精细定位与候选基因的确定：2014年在武汉种植了2500株的近等基因系背景f2大群体进行基因的精细定位，将基因定位在公共标记rm7389和indel标记id1约60kb的区间(图1)。通过对该区段基因进行功能预测，发现loc_os03g64070一个编码细胞分裂素激活酶的基因log-like5(其cds序列如seqidno:1所示，就是本发明后来命名的gy3基因)，并对log-like5进行比较测序，与“特青”相比，“02428”启动子中有一个3882bp的反转座子插入，并且atg上游的5’utr区域33bp处有一个9bp片段的插入，针对反转座子插入/缺失设计引物组合鉴定所有重组单株，发现它与表型共分离。log-like5编码细胞分裂素核苷5’-单磷酸磷酸核苷水解酶，可以促进细胞分裂素的合成。同时利用常规的realtime(kennethj.livak等，analysisofrelativegeneexpressiondatausingreal-timequantitativepcrandthe2-δδctmethod.methods,2001,25(4):402-408)的方法比较近等基因系幼穗中log-like5的表达，发现“特青”基因型具有更高的表达量。因此，本发明将它确定为候选基因。

(3)gy3基因的功能验证：利用pcr的方法从水稻“特青”中扩增出log-like5的cds，并连接到pu1301载体上，利用农杆菌介导的遗传转化方法将候选基因转入“02428”中。并在t0代进行表型考察，相比于转基因阴性植株，超表达log-like5的转基因植株平均每穗可以增加颖花数为56粒，单株产量增加11克，因此认定gy3的候选基因log-like5具有增加每穗颖花数和单株产量的功能。

(4)gy3基因使水稻骨干亲本显著增产：通过对水稻骨干品种的比较测序，发现籼稻骨干品种中gy3大部分都为特青等位基因型，所以，通过回交在主要的籼稻恢复系“93-11”、“明恢63”和“特青”中导入粳稻优良等位基因，改良后的骨干亲本单株产量均显著增加。

本发明的有益效果：

本发明克隆的水稻gy3基因，在不影响抽穗期的情况下，可显著增加水稻每穗颖花数和产量，可以通过改变它的表达量来实现水稻高产育种的应用。

附图说明

图1：本发明的总体技术路线图。附图标记说明：水稻品种“02428”与“特青”杂交产生f1后，以水稻品种02428为轮回亲本，经过连续的回交获得bc4f1，收取自交种，种植bc4f2分离群体进行qtl扫描。在第3染色体长臂末端检测到一个控制每穗颖花数和产量的qtlqgy3，挑选m43单株继续与02428回交并自交获得bc5f2群体，用于gy3的遗传分析以及精细定位。

图2：本发明精细定位中重要的重组单株。附图标记说明：黑线上方表示的是用于鉴定重组单株基因型的标记名称，重组单株的基因型一般为一侧基因型纯合另一侧基因型杂合，杂合基因型在重组单株的后代中存在分离。所以，分别种植重组单株自交后代bc5f3家系，对每个家系内所有单株用标记鉴定基因型，并根据基因型结果比较同一家系内纯合特青基因型与纯合02428基因型单株是否存在产量相关表型的显著差异，从而推断gy3的基因型。如图2中所示，分别列出了二次枝梗(secondarybranch)每穗实粒数(grainnumberperpanicle)和产量(yield)的考种数据，tqmean±sd代表每一个家系中基因型纯合为tq表型值的平均值±标准差，02428mean±sd代表每一个家系中基因型纯合为02428表型值的平均值±标准差。从图2可以发现，第2，3，4，5和9家系不同基因型之间存在表型的显著差异，因此确定gy3定位在rm7389到id1的区域内。

图3：本发明中近等基因系(nil)主茎穗两种基因型的比较。附图标记说明：近等基因系主茎穗的表型，近等基因系nil-02428与近等基因系nil-tq相比具有更多的二次枝梗以及每穗粒数。

图4：是本发明构建的近等基因系以及高产等位基因导入骨干品种的主茎穗表型。附图标记说明：图4中a图、图4中的b图和图4中的c图分别为“特青”(tq)和“tqgy3”、“明恢63”(mh63)和“mh63gy3”以及“93-11”和“93-11gy3”中的表型，其中：a1、b1、c1为整体株型图，a2、b2、c2和a3、b3、c3为成熟期穗型图，从图中可以发现，gy3的导入使稻穗明显变大，二次枝梗变多，可以起到增加这些品种穗大小的作用。

图5：本发明中所用到的过表达载体构建示意图。附图标记说明：本发明利用pcr扩增出gy3的cds，以kpni单酶切，用一步法连接到pu1301表达载体中图示黑箭头指示的多克隆位点上。

具体实施方式

对序列表的说明：

seqidno：1是本发明分离的gy3基因的编码区(cds)的核苷酸序列。

seqidno：2是gy3基因编码的蛋白质序列。

seqidno：3是gy3基因的等位基因(gy3tq)的编码区(cds)的核苷酸序列。

seqidno：4是gy3基因的等位基因(gy3tq)编码的蛋白质序列。

seqidno：5是水稻“02428”在gy3基因上游的反转座子核苷酸序列。

从水稻品种“特青”的导入系在第3染色体末端同时扫描到控制每穗颖花数和单株产量的qtl，挑选ssr标记rm16217为tq基因型的m43单株与02428继续回交纯化遗传背景，减少遗传背景的差异对基因定位的干扰，从而构建了近等基因系nil(gy3)，利用bc5f2分离群体进行遗传分析和qtl效应检测。筛选2500株的bc5f2群体中重组单株，并对重组单株进行后代测验，从而精细定位gy3，最后将gy3基因定位于从ssr标记rm7389至id1区域约60kb的区段。在此区间包含一个细胞分裂素活化酶基因log-like5，对log-like5的比较测序，发现亲本之间atg上游的5’utr中有9bp的插入/缺失，而对重组单株进行基因型鉴定发现这9bp的缺失与表型完全共分离，将此基因定为候选基因。将此基因的特青等位基因型接到pu1301超表达载体上转化“02428”，在t0代多个转基因阳性单株每穗颖花数变少，单株产量降低的表型，确认了log-like5就是gy3基因。

以下实施案例进一步定义本发明，并描述了gy3基因的分离克隆及功能验证。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。

实施例1：gy3的定位和效应分析

(1)gy3的发现：利用水稻品种“02428”(江苏省农业科学院惠赠)与水稻品种“特青”(广东省农业科学院黄耀祥院士选育和惠赠)进行杂交，获得杂交种f1，并以“02428”作为轮回亲本，连续回交4次获得bc4f1并自交，种植bc4f2家系(每个家系种植24株)，收集每个家系产量和每穗颖花数等性状的表型，结合“02428”和“tq”重组自交系(rils)遗传图谱构建所用的ssr标记(文献见：毛东海即mao,donghai等，epistasisandcomplementarygeneactionadequatelyaccountforthegeneticbasesoftransgressivesegregationofkilo-grainweightinrice.euphytica,2011,180:261-271)，鉴定基因型，利用单因素方差分析每一个ssr标记两种基因型之间是否存在连锁的每穗颖花数和产量相关的qtl。最终在第3染色体长臂末端的ssr标记rm148(www.gramene.org)附近鉴定到一个同时控制每穗颖花数和单株产量的qtlqgy3。

(2)gy3近等基因系的构建及效应评价：为了进一步解析这个影响水稻每穗颖花数单株产量的基因，本发明种植了140个单株的bc4f2群体，用ssr标记鉴定每一个单株的基因型，利用mapmaker构建局部区间遗传连锁图谱，然后利用用winqtlcartographer2.5软件选择复合区间作图法进行qtl扫描(文献见：zengzb.precisionmappingof5quantitativetraitloci.genetics,1994,136:1457-1468)，在bc4f2把gy3定位在第3染色体末端ssr标记rm148和rm16211之间，而根据140个单株后代测验bc4f3家系的表型，可以把gy3定位在rm16211和rm7389之间(文献见：biwu等，twoquantitativetraitlociforgrainyieldandplantheightonchromosome3aretightlylinkedincouplingphaseinrice,molbreeding,2015,35:156)。根据bc4f2和bc4f3家系定位结果不一致，推断可能是由于背景不纯从而影响定位结果，同时，申请人根据基因型挑选rm16217纯合为“tq即特青”的单株“m43”，将“m43”与“02428”继续回交一次并自交，获得bc5f2群体用于gy3效应的评价和基因的精细定位。在bc5f2群体中分别挑选30株纯合02428(nil-02428)和特青(nil-tq)基因型单株(穗型见图3)，考察每穗颖花数、每穗实粒数、一次枝梗、二次枝梗、千粒重和单株产量，结果如表1。

表1近等基因系产量性状比较

从表1可以看出，在近等基因系背景下，gy3为02428等位基因型的单株具有增加50多粒每穗颖花数和每穗实粒数，增加15个以上的二次枝梗和大约15克的单株产量。

(3)gy3的精细定位：在2500株的bc5f2群体里面，利用申请人自己设计的indel标记id8和rm16217鉴定每个单株基因型。挑选两侧标记基因型重组的单株进行后代测验，鉴定后代测验f3家系中每一个单株的基因型，并检测f3家系两种纯合基因型单株之间是否存在表型的显著性差异，来推断重组单株中gy3的基因型。通过在id8和rm16217之间增加分子标记并鉴定重组单株的基因型，结合gy3的基因型，可以把gy3定位在rm7389到id1的60kb的区域内。本发明新开发的indel标记的序列如表2。

表2gy3精细定位引物的序列

精细定位区域内包含一个注释为细胞分裂素激活酶的基因log-like5(登录号loc_os03g64070)(http://rapdblegacy.dna.affrc.go.jp/)等9个基因。log(takashik等，directcontrolofshootmeristemactivitybyacytokinin-activatingenzyme,2007,445:652-655)是水稻中一个细胞分裂素激活酶基因，突变稻穗变小，严重突变导致花器官的缺失。在拟南芥(kurohat等，functionalanalysesoflonelyguycytokinin-activatingenzymesrevealtheimportanceofthedirectactivationpathwayinarabidopsis,2009,21:3152-3169)中具有相似的功能。对log-like5的全长cds和启动子进行比较测序，发现02428启动子中有3882bp的反转座子gypsy-likeltr-retrotransposonfromrice(longterminalrepeat)插入，同时02428在距离翻译起始位点atg上游33bp处有一个gaccagcag的缺失。在02428和特青编码区鉴定到3个snp的差异，但不引起蛋白编码序列的改变。对log-like5表达量检测发现，相比于nil-02428，nil-tq表达量更高。所以推断反转座子的插入可能导致表达量的降低，从而增加穗粒数而提高产量。

利用反转座子的插入/缺失，设计了3条引物cl1f、cl1r和cl1-2f(引物序列见表3)鉴定水稻中有无反转座子的插入。运用引物组合如cl1f+cl1r和cl1-2f+cl1r对亲本02428和tq进行pcr扩增，可以鉴定亲本中是否存在反转座子的插入，亲本02428能顺利扩增出cl1-2f+cl1r而不能扩增出cl1f+cl1r，是有反转座子插入的类型，而特青能扩增出cl1f+cl1r而不能扩增出cl1-2f+cl1r，是无反转座子插入的类型。同时申请人对533份水稻种质群体(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室收集，http://ricevarmap.ncpgr.cn/v2/)dna进行pcr扩增，基本所有的粳稻都是有反转座子插入(cl1-2f+cl1r能扩增而cl1f+cl1r不能扩增)，而籼稻只有部分品种有反转座子插入(cl1f+cl1r能扩增而cl1-2f+cl1r不能扩增)，同时，申请人也鉴定了100多份的野生稻，一部分有反转座子插入，而一部分则没有。扩增所用引物序列如表3。

表3gy3启动子中反转座子插入/缺失鉴定定位的引物

实施例2：gy3的转基因功能验证

(1)转化片段的获得：利用表4所示的引物，从亲本特青中扩增产gy3的dna片段，所用程序和pcr反应条件如下：①94℃4分钟，②94℃30秒，③58℃30秒，④72℃1分钟30秒，⑤从步骤②－④循环35次，⑥72℃15分钟，⑦4℃保存。pu1301是本申请人所在作物遗传改良国家重点实验室改造的植物表达载体，通过在pcambia1301多克隆位点插入一个玉米的ubiquitin启动子和一个nos(synthasepolyadenylationsignal)终止子(图5)。从而利用ubiquitin启动子驱动外源基因进行过表达(qiud等，oswrky13mediatesricediseaseresistancebyregulatingdefense-relatedgenesinsalicylate-andjasmonate-dependentsignaling,molecularplant-microbeinteractions:mpmi,2007,20:492-499)。pu1301载体用kpni单酶切，将pcr产物和载体酶切产物利用fermentas公司的回收试剂盒回收(方法见说明书，货号#k0513)，并做一步法连接(方法参照gibsondg等，enzymaticassemblyofdnamoleculesuptoseveralhundredkilobases,naturemethods,2009,6:343-345)。

表4gy3的过表达转基因载体构建所用引物

(2)利用连接产物电转化大肠杆菌dh10b(电转仪为eppendorfelectroporator2510,电压参数为1800v，使用方法见说明书，大肠杆菌dh10b菌株购自promega公司)，连接产物涂于含30mg/l的卡那霉素的la平皿上，16h后挑取单菌落于1ml含30mg/l的卡那霉素的lb培养基中，培养12h后抽取质粒，利用kpni酶切检测阳性克隆(操作方法见j.萨姆布鲁克，ef弗里奇，t曼尼阿蒂斯著，黄培堂，王嘉玺等译，分子克隆实验指南(第三版)，科学出版社，2002版)。对阳性克隆进行测序，确认外源片段无突变。

(3)转化02428：将步骤(2)中构建好的载体电转化到农杆菌(a.tumefaciens)eha105(购自澳大利亚cambia实验室)，参考步骤(2)中连接产物的电转化方法。遗传转化02428方法参考hiei等人报道的方法(hiei等,efficienttransformationofrice(oryzasatival.)mediatedbyagrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesofthet-dna.plantj,1994,6:271-282)进行。

(4)得到t0代的转基因植株。转基因单株利用gus引物(表4)鉴定，能扩增出来的为转基因阳性单株，不能扩增的为转基因阴性单株。

表4转基因单株阳性鉴定引物

(5)通过对t0代过表达植株的产量相关表型进行考察，发现转基因阳性植株的每穗颖花数降低50粒左右，每穗实粒数降低40粒左右，二次枝梗降低10个左右，导致单株产量产量比02428阴性株降低约26克左右，从而验证了gy3基因通过提高表达量而降低水稻单株产量，这与nil-tq中gy3表达量高，而单株产量却降低的结果一致。至此，gy3基因被成功克隆，它通过表达量的提高，降低水稻二次枝梗，降低每穗颖花数和每穗实粒数，并降低水稻单株产量。

表5转基因单株产量相关性状考察

实施例3：用02428gy3等位基因改良骨干亲本

通过利用cl1f+cl1r的引物组合对水稻品种93-11(江苏里下河地区农业科学研究所选育和惠赠)、明恢63(福建省三明市农业科学研究所谢华安院士选育和惠赠)和特青(广东省农业科学院黄耀祥院士选育和惠赠)进行基因型鉴定，发现都没有反转座子插入。在在自交系(nil)中，相对于nil-tq而言，nil-02428具有增加产量的作用。为了验证粳稻等位基因型的gy3是否在籼稻背景下同样具有增产的作用，本发明挑选93-11、特青和明恢63作为受体亲本，以02428作为供体亲本，分别杂交后得到f1，并连续与受体亲本回交4次，并运用引物组合cl1f+cl1r和cl1-2f+cl1r对gy3基因进行选择，分别获得了93-11、明恢63和特青背景下gy3为02428基因型的bc4f1，自交获得bc4f2，种植bc4f2并考察了影响产量的相关性状(图4)。对产量性状进行考察均具有很好的增产效果。

本发明的遗传转化的主要步骤、培养基及其配制的方法如下所述：

(1)试剂和溶液缩写本发明中培养基所用到的植物激素的缩写表示如下：6-ba(6-benzylaminopurine，6-苄基腺嘌呤)；cn(carbenicillin，羧苄青霉素)；kt(kinetin，激动素)；naa(napthaleneaceticacid，萘乙酸)；iaa(indole-3-aceticacid，吲哚乙酸)；2,4-d(2,4-dichlorophenoxyaceticacid，2,4-二氯苯氧乙酸)；as(acetosringone，乙酰丁香酮)；ch(caseinenzymatichydrolysate，水解酪蛋白)；hn(hygromycinb，潮霉素)；dmso(dimethylsulfoxide，二甲基亚砜)；n6max(n6大量元素成分溶液)；n6mix(n6微量元素成分溶液)；msmax(ms大量元素成分溶液)；msmix(ms微量元素成分溶液)

(2)主要溶液配方

1)n6培养基大量元素母液(按照10倍浓缩液(10x)配制)：

将上述试剂逐一溶解，然后室温下用蒸馏水定容至1000毫升。

2)n6培养基微量元素母液(按照100倍浓缩液(100x)配制

将上述试剂在室温下溶解并用蒸馏水定容至1000毫升。

3)铁盐(fe2edta)贮存液(按照100x浓缩液配制)

将3.73克乙二铵四乙酸二钠(na2edta·2h2o)和2.78克feso4·7h2o分别溶解，混合并用蒸馏水定容至1000毫升，至70℃温浴2小时，4℃保存备用。

4)维生素贮存液(按照100x浓缩液配制)

加蒸馏水定容至1000毫升，4℃保存备用。

5)ms培养基大量元素母液(msmax母液)(按照10x浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

6)ms培养基微量元素母液(msmin母液)(按照100x浓缩液配制)

将上述试剂在室温下溶解，并用蒸馏水定容至1000毫升。

7)2,4-d贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取2,4-d100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，于室温下保存。

8)6-ba贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取6-ba100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，室温保存。

9)萘乙酸(naa)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取naa100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

10)吲哚乙酸(iaa)贮存液(1毫克/毫升)的配制：

秤取iaa100毫克，用1毫升1n氢氧化钾溶解5分钟，然后加10毫升蒸馏水溶解完全后定容至100毫升，4℃保存备用。

11)葡萄糖贮存液(0.5克/毫升)的配制：

秤取葡萄糖125克，然后用蒸馏水溶解定容至250毫升，灭菌后4℃保存备用。

12)as贮存液的配制：

秤取as0.392克，加入dmso10毫升溶解，分装至1.5毫升离心管内，4℃保存备用。

13)1n氢氧化钾贮存液秤取氢氧化钾5.6克，用蒸馏水溶解定容至100毫升，室温保存备用。

(3)用于水稻遗传转化的培养基配方

1)诱导培养基

加蒸馏水至900毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口后按常规方法灭菌(例如121℃下灭菌25分钟，下述的培养基灭菌方法与本培养基的灭菌方法相同)。

2)继代培养基

加蒸馏水至900毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，煮沸并定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(25毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

3)预培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升as贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

4)共培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.6，封口，按上述方法灭菌。

使用前加热溶解培养基并加入5毫升葡萄糖贮存液和250微升as贮存液，分装倒入培养皿中(25毫升/每皿)。

5)悬浮培养基

加蒸馏水至100毫升，调节ph值到5.4，分装到两个100毫升的三角瓶中，封口，按上述方法灭菌。

使用前加入1毫升无菌葡萄糖贮存液和100微升as贮存液。

6)选择培养基

加蒸馏水至250毫升，调节ph值到6.0，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，加入250微升hn(50毫克/毫升)和400微升cn(250毫克/毫升)分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。(注：第一次选择培养基羧苄青霉素浓度为400毫克/升，第二次及以后选择培养基羧苄青霉素浓度为250毫克/升)。

7)预分化培养基

加蒸馏水至250毫升，1n氢氧化钾调节ph值到5.9，封口，按上述方法灭菌。

使用前溶解培养基，250微升hn(50毫克/毫升)250微升cn(250毫克/毫升)，分装倒入培养皿中(25毫升/皿)。

8)分化培养基

加蒸馏水至900毫升，1n氢氧化钾调节ph值到6.0。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到50毫升三角瓶(50毫升/瓶)，封口，按上述方法灭菌。

9)生根培养基

加蒸馏水至900毫升，用1n氢氧化钾调节ph值到5.8。

煮沸并用蒸馏水定容至1000毫升，分装到生根管中(25毫升/管)，封口，按上述方法灭菌。

(4)农杆菌介导的遗传转化步骤

愈伤诱导

将成熟的02428水稻种子去壳，然后依次用70％的乙醇处理1分钟，0.15％氯化汞(hgcl2)种子表面消毒15分钟；

用灭菌水洗种子4-5次；

将种子放在诱导培养基上；

将接种后的培养基置于黑暗处培养4周，温度25±1℃。

3.2愈伤继代挑选亮黄色、紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于继代培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.3预培养

挑选紧实且相对干燥的胚性愈伤，放于预培养基上黑暗下培养2周，温度25±1℃。

3.4农杆菌培养

1)在带有对应抗性选择的la培养基(la培养基的配制参照j.萨姆布鲁克等，分子克隆实验指南，第三版，金冬雁等(译)，科学出版社，2002，北京)上预培养农杆菌eha105(该菌株来自cambia公司公开使用的农杆菌菌株)两天，温度28℃；

将农杆菌转移至悬浮培养基里，28℃摇床上培养2-3小时。

3.5农杆菌侵染

1)将预培养的愈伤转移至灭好菌的瓶子内；

调节农杆菌的悬浮液至od6000.8-1.0；

将愈伤在农杆菌悬浮液中浸泡30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；然后放置在共培养基上培养3天，温度19-20℃。

3.6愈伤洗涤和选择培养

1)灭菌水洗涤愈伤至看不见农杆菌；

浸泡在含400毫克/l羧苄青霉素(cn)的灭菌水中30分钟；

转移愈伤至灭菌好的滤纸上吸干；

转移愈伤至选择培养基上选择培养2-3次，每次2周。

3.7分化

1)将抗性愈伤转移至预分化培养基上于黑暗处培养5-7天；

转移预分化培养的愈伤至分化培养基上，光照下培养，温度26℃。

3.8生根

1)剪掉分化时产生的根；

然后将其转移至生根培养基中光照下培养2-3周，温度26℃。

3.9移栽

洗掉根上的残留培养基，将具有良好根系的幼苗转入大田隔离环境，田间管理同普通大田。

特别说明：本申请涉及的水稻材料中，在材料的名称中加“”号，与不加“”号的材料名称是同一个材料。

序列表

<110>华中农业大学

<120>gy3基因在控制水稻每穗颖花数和单株产量中的应用

<141>2019-03-04

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>741

<212>dna

<213>水稻(oryzasativa)

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