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一种嘉宝果的脱毒微繁方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-12-02 11:02

本发明属于植物种苗繁育技术领域。更具体地，涉及一种嘉宝果的脱毒微繁方法。

背景技术：

嘉宝果（myrciariacaulifloraberg），别名珍宝果、树葡萄、拟爱神木等，英文名为“jaboticaba”，其是桃金娘科拟香桃木属一种热带亚热带水果，其原产于南美洲的巴西等国家，素有“水果之王”之美誉，其富含花青素、黄酮类、维生素c、维生素b、硫胺素、烟酸、钙、磷、铁等多种营养成分，其果实不仅用用于鲜食水果外，还可被加工成果冻、蜜饯、果酱、果酒、风味食品、食品添加剂等，近年，更有将其研发成保健食品和化妆品的报道，在欧美、日本、台湾、香港等发达国家和地区，有重要的市场潜力和推广价值。

近年，我国的台湾、福建、海南、广东、湖南等地区多有引种，且发展迅速。由于嘉宝果为多年生木本果实，种苗生长缓慢，果实成熟周期较长，种子成熟度不一，加上种子狭小，种皮坚硬，所以依赖于种子的种苗繁育周期较长，出苗不一致，远远不能满足市场的需要，魏方稳等（魏方稳，陈福梓，张琳，庄文晶，李丽容.不同季节iaa对嘉宝果扦插生根的影响，福建热作科技，2015，40（4）:20-21）以嘉宝果扦插育苗进行了研究，结果表明：当使用1%高锰酸钾和500～1500mg/liaa处理后，可将嘉宝果的扦插成活率从10%提高至23.3～63.3%，提高了嘉宝果的种苗繁育效率，但是同样无法解决种苗繁育中存在的成活率低、种苗带病毒、种苗繁育受季节限制、繁殖周期长，增殖率低等问题。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是克服上述现有嘉宝果种苗繁育中存在的问题和技术不足，利用组织培养培养技术，通过对脱毒方法的建立、微枝培养、增殖培养和生根培养，建立了嘉宝果的脱毒微繁方法，可有效解决种苗繁育效率低、带病毒、受季节限制、繁殖周期长，增殖效率低、成本高和遗传稳定性差等问题，为嘉宝果种苗的工业化生产和嘉宝果种质资源的脱病毒引进奠定了基础。

本发明的目的是提供一种嘉宝果的脱毒微繁方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

一种嘉宝果的脱毒微繁方法，包括如下步骤：

s1.外植体的消毒及无菌苗的培养：将嘉宝果外植体消毒0.5～10min，接种培养为无菌苗；

s2.增殖培养：将增壮后的无菌苗切割成带有1个顶芽或1～2个腋芽，且长度为1.0～2.0cm的茎段，接种于增殖培养基进行增殖培养；

s3.生根培养：待微枝生长长度为2.0～3.0cm时，转接于生根培养基中进行生根培养；

s4.炼苗培养：将生根培养后的嘉宝果苗于隐蔽度为15%～20%的荫棚，炼苗7～10d；

s5.移栽：将经过炼苗后的嘉宝果苗移栽于含复合栽培基质的育苗杯，即完成嘉宝果的脱毒微繁；所述复合栽培基质由如下组成构成：30%～40%蛭石、30%～40%牛粪、20%～30%椰糠。

其中，步骤s1所述嘉宝果外植体为嘉宝果嫩枝、果实或种子。具体可为从国内外引进或种植基地采集的嘉宝果嫩枝或果实。

优选地，步骤s1所述消毒所用的消毒剂为含有酒精、氯化汞、次氯酸钠或吐温中的一种或几种的复合消毒剂。

优选地，步骤s1中外植体的消毒方法具体为：

（1）当外植体为从国内外引进或种植基地采集的嘉宝果嫩枝时，其消毒方法为：首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡30～60s，然后用无菌水冲洗3～5次，再用含有质量浓度1%吐温和0.1%的氯化汞或用含有质量浓度1%吐温和5%次氯酸钠的复合消毒剂消毒7min，然后用无菌水冲洗3～5次，即为无菌外植体；

（2）当外植体为从国内外引进或种植基地采集的嘉宝果果实或种子时，其消毒方法为：首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡30～60s，然后用无菌水冲洗3～5次，再用含有质量浓度1%吐温和0.1%的氯化汞或用含有质量浓度1%吐温和5%次氯酸钠的复合消毒剂消毒15min，然后用无菌水冲洗3～5次，即为无菌外植体；

（3）当外植体采集地，即种苗繁育基地为病毒多发地区时，其消毒方法为：使用10～30mg/ml的甲基硫菌灵、苯菌灵、多菌灵或硫菌灵连续喷施1周后，然后进行外植体的采集。

另外优选地，步骤s1所述接种培养使用的培养基为：以改良hb或ms培养基为基本培养基，增加2.0%～20.0%的椰子乳、土豆泥、胡萝卜泥的一种或多种有机附加物。

或步骤s1所述接种培养使用的培养基为：以改良hb或ms固培养基为基本培养基，附加5.0%的椰子乳有机物。

优选地，步骤s1所述接种培养为：温度为25～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为80～100lx、光照8～10h/d的条件下培养至无菌苗长度为0.5～1.0cm。

优选地，步骤s2所述增殖培养基为：以hb或ms固培养基为基本培养基，且还包含0.5～3.0mg/l的6-ba、0.05～0.5mg/l的tdz、0.05～0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6～6.0。

更优选地，步骤s2所述增殖培养基为：以hb或ms固培养基为基本培养基，且含有2.0mg/l的6-ba、0.2mg/l的tdz和0.1mg/l的naa。

另外，步骤s2所述增殖培养基中还可以含有体积分数2.0%～20.0%的椰子乳、土豆泥、胡萝卜泥中的一种或多种有机附加物。

优选地，步骤s2所述增殖培养为：在温度为25～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为80～100lx、光照8～10h/d的条件下培养，视种苗需求数量可进行连续增殖。

优选地，步骤s3所述生根培养基为：以改良hb或ms固培养基为基本培养基，且还包含0.05%～1.0%的活性炭或0.05～0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6～6.0。

更优选地，步骤s3所述生根培养基为：以改良hb或ms固培养基为基本培养基，且还包含0.1%～1.0%的活性炭或0.05～0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6～6.0。

或步骤s3所述生根培养基为：以改良hb或ms固培养基为基本培养基，且还包含0.2%的活性炭。

或步骤s3所述生根培养基为：以改良hb或ms固培养基为基本培养基，且还包含0.2mg/l的naa。

另外，步骤s3所述生根培养基中还可以含有体积分数2.0%～20.0%的椰子乳、土豆泥、胡萝卜泥中的一种或多种有机附加物。

优选地，步骤s3所述生根培养为：在温度为25～28℃、湿度为70%～80%、光照强度为80～100lx、光照8～10h/d的条件下培养至嘉宝果微枝根的生长长度为1.5～2.0cm。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种嘉宝果脱毒微繁方法，由外植体消毒、增殖培养、生根培养、炼苗培养等过程实现，该方法低成本、稳定一致、增殖效率高，解决了嘉宝果种苗繁育中存在的成活率低、种苗带病毒、种苗繁育受季节限制、繁殖周期长，增殖率低等问题，对嘉宝果的种苗繁育和推广具有重要的意义，具有重要的市场潜力和经济效益前景。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围；若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

本实施例中污染率是指接种10d后被细菌或真菌污染的外植体瓶数占总接种瓶数的百分率；褐化率是指接种10d后外植体褐化变黑的瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖率是指接种10d后外植体开展生长的瓶数占总接种瓶数的百分率；增殖系数是指接种30d后，与原接种量相比，增殖的倍数百分率。

实施例1

一种嘉宝果的脱毒微繁方法，步骤如下：

①外植体消毒，将从国内种植基地采集的嘉宝果嫩枝，首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡30s，然后用无菌水冲洗3次，再用含有质量浓度为1%吐温和0.1%氯化汞的复合消毒剂消毒7min，然后用无菌水冲洗3次，即为无菌外植体。

②增殖培养，其将消毒后的嘉宝果外植体接种于以ms固培养基为基本培养基，且还包含0.5mg/l的6-ba、0.05mg/l的tdz、0.05mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6的增殖培养基进行增殖培养。

③生根培养，将生长长度为2.0～3.0cm微枝的接种于以ms固培养基为基本培养基，且还包含0.1%的活性炭和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为6.0。

④炼苗培养，将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为15%的荫棚，炼苗7d。

⑤将经过炼苗后艾纳香组培苗移栽于含30%蛭石，40%牛粪，30%椰糠的育苗杯。

本实例中的嘉宝果消毒污染率20%，褐化率15%，增殖率65%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为4.7，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.5～0.7cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为5～7条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率90%。

实施例2

一种嘉宝果的脱毒微繁方法，步骤如下：

①外植体消毒，将从国外引进的嘉宝果嫩枝，首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡60s，然后用无菌水冲洗5次，再用含有质量浓度为1%吐温和5%次氯酸钠的复合消毒剂消毒7min，然后用无菌水冲洗5次，即为无菌外植体。

②增殖培养，其将消毒后的嘉宝果外植体接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含3.0mg/l的6-ba、0.5mg/l的tdz、0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为6.0的增殖培养基进行增殖培养。

③生根培养，将生长长度为2.0～3.0cm微枝的接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含1.0%的活性炭和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6。

④炼苗培养，将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为20%的荫棚，炼苗10d。

⑤将经过炼苗后艾纳香组培苗移栽于含40%蛭石，40%牛粪，20%椰糠的育苗杯。

本实例中的嘉宝果消毒污染率40%，褐化率10%，增殖率50%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为7.3，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率95%。

实施例3

一种嘉宝果的脱毒微繁方法，步骤如下：

①外植体消毒，将从国外引进嘉宝果种子，首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡60s，然后用无菌水冲洗5次，再用含有质量浓度为1%吐温和0.1%氯化汞的复合消毒剂消毒15min，然后用无菌水冲洗5次，即为无菌外植体。

②增殖培养，其将消毒后的嘉宝果外植体接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含0.5mg/l的6-ba、0.1mg/l的tdz、0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为6.0的增殖培养基进行增殖培养。

③生根培养，将生长长度为2.0～3.0cm微枝的接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含0.1mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6。

④炼苗培养，将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为20%的荫棚，炼苗10d。

⑤将经过炼苗后艾纳香组培苗移栽于含40%蛭石，30%牛粪，40%椰糠的育苗杯。

本实例中的嘉宝果消毒污染率20%，褐化率0%，增殖率80%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为6.2，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率93%。

实施例4

一种嘉宝果的脱毒微繁方法，步骤如下：

①外植体消毒，将从国内种植基地收集的嘉宝果果实，首先使用清洁剂清洗后，用流水冲洗至净，然后于75%的乙醇溶液浸泡60s，然后用无菌水冲洗3次，再用含有质量浓度为1%吐温和0.1%氯化汞的复合消毒剂消毒15min，然后用无菌水冲洗3次，即为无菌外植体。

②增殖培养，其将消毒后的嘉宝果外植体接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含2.0mg/l的6-ba、0.2mg/l的tdz、0.1mg/l的naa和体积分数为5.0%的椰子乳有机附加物，质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为6.0的增殖培养基进行增殖培养。

③生根培养，将生长长度为2.0～3.0cm微枝的接种于以hs固培养基为基本培养基，且还包含0.05mg/l的naa和质量浓度为3.0%的蔗糖，ph值为5.6。

④炼苗培养，将生根培养的艾纳香苗于隐蔽度为20%的荫棚，炼苗10d。

⑤将经过炼苗后艾纳香组培苗移栽于含40%蛭石，30%牛粪，40%椰糠的育苗杯。

本实例中的嘉宝果消毒污染率18%，褐化率0%，增殖率82%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为13.7，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率97%。

实施例5

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤①中的外植体采集地区为病毒多发地区，结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率50%，褐化率20%，增殖率30%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为4.5，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率87%。

实施例6

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤①中的外植体采集地区为病毒多发地区，其外植体在采集前先使用30mg/ml的甲基硫菌灵连续喷施1周后，然后进行外植体的采集和消毒。

结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率20%，褐化率10%，增殖率70%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为6.4，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率92%。

实施例7

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤①中的外植体采集地区为病毒多发地区，其外植体在采集前先使用10mg/ml的苯菌灵连续喷施1周后，然后进行外植体的采集和消毒。

结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率40%，褐化率10%，增殖率50%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为5.7，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.5cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为7～10条，根长3～5cm，经炼苗后移栽成活率89%。

实施例8

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤①中的外植体采集地区为病毒多发地区，其外植体在采集前先使用20mg/ml的多菌灵连续喷施1周后，然后进行外植体的采集和消毒。

结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率30%，褐化率20%，增殖率50%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为5.4，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.2～0.3cm，苗高3～4cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为8～10条，根长4～5cm，经炼苗后移栽成活率93%。

实施例9

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤①中的外植体采集地区为病毒多发地区，其外植体在采集前先使用20mg/ml的硫菌灵连续喷施1周后，然后进行外植体的采集和消毒。

结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率15%，褐化率12%，增殖率73%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为6.5，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.2～0.4cm，苗高3～4cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为12～15条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率94.7%。

实施例10

实验方法同实施例1，唯一不同的是步骤②和③中的培养基中均含有2%的椰子水有机附加物。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率18%，褐化率12%，增殖率76%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为8.4，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高5～7cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为12～15条，根长4～5cm，经炼苗后移栽成活率95.7%。

实施例11

实验方法同实施例2，唯一不同的是步骤②和③中的培养基中均含有20%的椰子水有机附加物。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率34%，褐化率16%，增殖率50%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为9.6，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.2～0.3cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为8～10条，根长2～3cm，经炼苗后移栽成活率93.4%。

实施例12

实验方法同实施例3，唯一不同的是步骤②和③中的培养基中均含有10%的香蕉泥有机附加物。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率14%，褐化率2%，增殖率84%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为8.2，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.2～0.3cm，苗高4～5cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为8～10条，根长2～3cm，经炼苗后移栽成活率93.7%。

实施例13

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②和③中的培养基中除了含有5.0%的椰子乳有机附加物，还含有5%的土豆泥有机附加物。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率20%，褐化率3%，增殖率77%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为11.6，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高5～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长5～7cm，经炼苗后移栽成活率96.6%。

实施例14

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②和③中的培养基中除了含有5.0%的椰子乳有机附加物，还含有5%的胡萝卜泥有机附加物。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率16%，褐化率2%，增殖率82%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为12.4，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高5～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率96.8%。

实施例15

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②增殖培养基中的6-ba、tdz和naa的浓度分别为1.0mg/l、0.2mg/l和0.1mg/l。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率21%，褐化率4%，增殖率75%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为12.7，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高4～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率96%。

实施例16

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②增殖培养基中的6-ba、tdz和naa的浓度分别为2.0mg/l、0.1mg/l和0.1mg/l。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率20%，褐化率3%，增殖率77%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为11.6，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高4～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率95.4%。

实施例17

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②增殖培养基中的6-ba、tdz和naa的浓度分别为0.8mg/l、0.5mg/l和0.1mg/l。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率24%，褐化率3%，增殖率73%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为12.6，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高4～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率96.4%。

实施例18

实验方法同实施例4，唯一不同的是步骤②增殖培养基中的6-ba、tdz和naa的浓度分别为1.5mg/l、0.2mg/l和0.05mg/l。结果表明：本实例中的嘉宝果消毒污染率22%，褐化率3%，增殖率75%，丛生苗诱导率为100%，月增殖系数为12.8，壮苗培养后苗粗壮，其茎粗达到0.3～0.4cm，苗高4～6cm，其经过生根以后，其生根率为100%，平均根条数为10～12条，根长3～4cm，经炼苗后移栽成活率96.6%。