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细胞学研究方法

来源：花匠小妙招时间：2024-12-01 04:11

1、第一章植物染色体制片技术染色体是细胞核中由DNA、蛋白质和少量RNA组成的易被碱性染料着色的一种丝状或杆状物。也是遗传物质的载体。它可被苏木精、蕃红、结晶紫、吉姆萨、醋酸洋红、地衣红和孚尔根染液等染色。染色体为细胞中最重要的遗传结构。对染色体的结构与功能的研究一直是细胞学、遗传学中的重大课题。农学家要了解农作物的生物学特性，不能不掌握有关农作物的知识，而对于农作物育种学家来说，掌握和研究植物染色体则是工作的基础。经过众多研究者的不懈努力，植物染色体的研究技术得到了长足的发展,也为育种学家提供了充分的理论依据和实践基础。 1、染色体研究技术的发展历史1888年瓦尔德第一次提出了染色体这一

2、名词。1910年摩尔根研究果蝇的染色体以来，染色体研究进入了鼎盛时期。染色体的制作方法和技术始终是一大难关。在EBWilson的巨著(The Cell)的1947年版本中，Hde Winiwarter于1912和1921两次定的人的二倍体染色体数是47和48，TSPainLer于1921和1922定的数目，单倍体是24，二倍体是48。1956年JH与A1evan在瑞典的Hereditas 上发表人的染色体数时，确切是46。而技术上加以突破性改进的两人竟都是搞植物细胞遗传的，而且第一作者， Tjio是一位中国人，名字叫蒋有兴。其发表的照片质量高，它可以使任何未经专门训练的人，不但能数清染色体数

3、目，而且还能给每个染色体找到它的同源伙伴。 Belling（1921）创用的乙酸洋红染色压片法，带动了以研究染色体数目、结构和行为变异与遗传的细胞遗传学和细胞分类学的建立和发展；Caspersson（1969）首创的染色体分带技术，揭示了染色体的内部结构分化，使对染色体的鉴别和分析更为准确；同年，Gall等创建的DNA分子原位杂交技术及其以后的不断改进，现已发展可以对单拷贝基因、重复序列以及整个基因组DNA进行准确定性、定位和相对定量的研究。2、染色体制片技术2.1制片方法的选择国内外通用的制备植物染色体标本的基本方法是压片法和去壁低渗火焰干燥法。前者为传统技术，后者为70年代末由陈瑞阳创用

4、的新方法。国外，仍以压片为主；在国内，两种方法都普遍应用，只是个人有偏爱而已。其具体的染色体制片方法如下图： 2.2制片程序2.2.1取材（基础）原则：进行细胞分裂的分生器官、组织或单个细胞均可。根尖：取材方便，分生区集中易判断。禾本科，单子叶0.5-2cm；双子叶，2-4cm（大），0.5-1.5cm（小）裸子植物，2-4cm。提高分裂指数：同步化处理、变温处理（4-10）茎尖：效果比根尖差，受季节限制，分裂指数低，不适宜用压片法。芽长0.5cm内。幼小花蕾：比茎尖有价值，因处于花粉母细胞减数分裂之前，有用的部分是花药和子房。纵切为二或四进行处理。愈伤组织：因为老化和分裂的细胞混杂，

5、所以较困难，应以转至新的培养基，愈伤组织大量增殖时取为适宜。2.2.2预处理（关键）预处理作用：抑制微管蛋白组装成纺锤丝，但并不抑制前期的细胞分裂，因此，凡进入中期的均被阻而不能进入后期，积累大量中期分裂相。可诱导染色体进一步缩短变直，便于染色体分散和使染色体形态更清晰。预处理药物的种类、特点及选择：秋水仙素（colchicine），常用浓度0.05-0.2%水溶液，易溶于冷水，有剧毒；高温与照光易失效，现配现用。适用于大、中、小染色体。对二氯苯（p-Dichlorobenzene pDB），常用饱和液，溶于乙醇等有机溶剂，难溶于水。适用于大、中、小染色体，尤其适合染色体计数；使染色体易于分

6、散较好，但显示缢痕较差。8-羟基喹啉（8-hydroxyquinoline），多用0.002mol/L水溶液。适宜中、小染色体，离体处理好。优点在于显示缢痕清晰，缺点在于中期分裂相不如其他的多，但总体优于其他药物。-溴萘（-Bromonaphthalene ）,饱和液现配最好，适于禾本科及水生植物，活体处理。100ml加2滴即可。放线菌酮（cycloheximide）,适宜早中期染色体供核型分析和G-带研究。20-50ppm，小染色体用低浓度，大染色体用高浓度混合处理液对二氯苯+-溴萘，100ml对二氯苯饱和液加1-2滴-溴萘，对大、中染色体作用迅速。可在短时间内明显缩短。秋水仙+8-羟基

7、喹啉，等量混合。适做核型。 8-羟基喹啉+放线菌酮预处理方法 A、离体处理即将器官、组织从母体上切割下来处理。注意事项1、材料要少，大10，小152、材料要小，切口邻近分生区，2-3mm3、经常振摇4、处理期间，更换预处理液5、尽量避光处理6、温度在20左右为佳，最忌高温。B非离体处理主要指根尖材料。许多蔬菜和花卉的种子小、根也小。染色体较大的植物，C、其他方法（低温处理）适当低温，也可抑制微管蛋白的合成与组装成纺锤体，与药物有相同功效。但适用的作物类别少，麦类常用。2.2.3前低渗 0.075mol/L kcl，20-30min，严格控制浓度。作用：利用细胞内外溶液的渗透压加

8、大，促使细胞膜充分膨胀，利于染色体的自由铺展。2.2.4固定目的：将细胞杀死，并保持染色体的固有形态和结构，可增强细胞的透性和易于染色。时间：1h。配方：无水乙醇：冰乙酸=3：1 甲醇：冰乙酸=3：1 95%乙醇：冰乙酸：三氯甲烷=5：3：2甲、乙醇可迅速透入细胞而使细胞失活、硬化，并可溶解部分脂类物质。但不能沉淀核蛋白。冰乙酸能凝固核蛋白，为固定染色体的主要成分。并可使细胞膨胀和软化。这两种成分均具有防腐和保存剂作用。单独用一种不能有优良的固定效果。三氯甲烷的目的是提高固定液的溶脂性能。2.2.5酶处理压片法一般只需纤维素酶处理即可，必要时也只需加纤维素用量的1/5-1/10

9、。在去壁低渗法中，既要使细胞壁完全被消化，又要使染色体完好无损，掌握好酶解条件，使之恰倒好处，便成为该步骤的技术难点，为此，应注意如下几点：（1）酶液浓度应控制在2.5%-5%，根尖2.5%，幼叶、幼芽5%。（2）酶解时间应视材料老嫩、大小和种类而作变动，一般以3小时为基准。（3）温度要恒定，通常用25-27。之后将酶液浓度及处理温度恒定，只要变动处理时间便可以找到合适的综合条件。2.2.6后低渗所谓后低渗即水清洗，水溶液相对于酶溶液而言可认为是低渗液。其目的有两方面：（1）洗除残留酶液。（2）使细胞进一步膨胀而有利于染色体铺展。一般10分钟左右，太短：不利于铺展。太长：可能导致无细胞

10、壁束缚的细胞因过度膨胀而破裂，使染色体丢失。2.2.7再固定、涂片后低渗之后，可直接涂片。但因材料膨胀软化，不易操作，故需再固定使材料硬化。时间从十分钟至数小时不等。涂片时用冰冻洁片。（涂片后自然风干或用吹风吹干片） 2.2.8染色一.压片法染色剂：压片法的几种染色程序：取材预处理固定 2%地衣红+1mol/L Hcl 1M Hcl 1M Hcl 1M Hcl （9：1） 60±1 加热或室温加热或室温 1%地衣红压片 Feulgen反应铁矾苏木精染酶解 45%乙酸压片 45%乙酸再固定分色和压片卡宝品红染色和压片1.

11、地衣红染色压片法：该法国外应用普遍，特点：将解离与染色结合，同步操作，很简便。程序：地衣红+HCL于试管中材料与染色液加入酒精灯加热染色液将沸而未沸时静置染色30分钟取出材料用不含HCL的1%乙酸地衣红压片。注意：（1）染色时间据材料而变，材料大或硬，延长至1小时或更长。但不能太长，因HCL过度处理反而使染色体着色困难。（2）若染色太深，用45%乙酸压片，可达到适当分色的效果。（3）无论用1%乙酸地衣红或45%乙酸压片，之前均不宜在酒精灯上加热，否则将褪色。（4）若压片之后，反差不好，细胞质着色太深，则可在酒精灯上微热以适度褪色，增加反差。缺点：细胞质易着色而影响反差。优点：地衣红比洋红的着

12、色力强，易于显示染色体细微结构变化。3.卡宝品红（石炭酸品红）染色卡宝品红是80年代创用的一种优良的染色体染色剂，也是目前国内应用最广的一种植物染色体染色剂。程序：与乙酸洋红或地衣红染色法相同。注意：（1）Hcl水解时间不足时，细胞质也着色，反差降低、过长，染色体浅淡。（2）材料经Hcl水解后，务必将Hcl用水彻底洗净，方可染色，否则将不易染色。优点：（1）分色清晰，操作简便、快速。（2）染色剂耐保存，稳定性好，制片后颜色耐久不褪色。（3）可滴染，也可整体预染。（4）适用于各类植物染色体染色。二、去壁低渗-火焰干燥法染色通常用2%-5%Giemsa（PH6.8-7.2）染色几分钟至几十分钟

13、不等。染色后，用蒸馏水洗净、空气干燥。2.2.9显微摄影：采用草绿色滤镜以滤去细胞质干扰。2.3 去壁低渗法的优点1.效率高：用根尖压片法观察染色体并不困难，但获得染色体分散好，能供核型分析用的细胞频率较低，特别是对染色体数目多、形态又小的植物，用压片法是较难的。而去壁低渗法有时一次就能得到近百个能数清染色体的细胞。2.4 制片过程中的问题及可能原因（对两种方法）1.一张优良的体细胞染色体制片的要求（1）在一张制片上有较多的中期分裂相，见不到后期和末期的分裂相，说明材料生长正常，预处理也适合。（2）染色体分散而不重叠，或少数染色体重叠，但单个染色体的形态可以辨认，一个没有经验的人也可准确计数。

14、（3）染色体不扭曲，不断裂，主缢痕和次缢痕以及随体都清晰可见。（4）染色体基本处于同一平面上。（5）染色体着色较深，细胞质无色或只染上极为浅淡的颜色。要达到以上高标准要求取决于两个因素：一是取材，二是操作技术。2.制片中存在的问题及原因（1）制片中的细胞极少。原因： a.材料本身很少。 b.材料软化或酶解不够。 c.材料软化或酶解过度。（2）制片中极少甚至没有中期分裂相。原因：a.植物生长条件不良，即：无细胞分裂。b.预处理液浓度太高，产生严重危害。c.根尖很小，操作时把分生区当作根冠而切除掉。d.材料具染色体，但因染色体极小，在低倍或中倍显微镜下观察不仔细，不善识别等产生观察错误（初学者易

15、犯）（3）细胞不易分离原因：主要是解离时间或温度不够。（4）虽经过预处理，制片中仍可见到后、末期分裂相。原因：为预处理不足的明显标志。即预处理液未能阻止纺锤丝的形成和活动，使细胞分裂过程能顺利进行到底。这主要是预处理液变质或处理时间太短所致。（5）染色体发生粘连或聚集成团而不分散。原因：a.预处理液浓度太高或温度太高。b.固定时间太短。c.软化或酶解时间太长，染色体过度膨胀。（6）细胞核或染色体完全解体，而只能看见细胞壁或细胞核与染色体只见染色成淡、残缺不全的轮廓，有时可见到细胞核碎裂成大小不等的碎块。原因：a.Hcl解离时，浓度太高或温度太高或时间太长。b.酶处理时，酶本身不纯，杂有蛋白

16、酶或DNA酶。（7）染色体周围发须，呈解螺旋状。原因：常见于去壁低渗法制片中。a.烤片太久。b.烤片时，其上的固定液燃烧，导致高温所致。第三章核型和核型分析1848年Hofmeister发现染色体 1888年 Waldeyer定名为染色体在细胞分裂的不同时期，染色体具有不同的形态结构。前期：表现出清楚的结构特征，如染色粒、常染色质，异染色质，核仁，核仁组织等，染色体节等。但染色体处于动态的收缩过程中，其各部分收缩速度与程度不均一。中期：染色体在浓缩上处于相对稳定时期，具有典型的外型特征，作核型分析最为合适。核型（Karyotype）：a.Battaglia（1952）定义：核型是一个体或

17、一群亲缘关系近的个体染色体组分中的染色体数目、大小和形态。b.Stebbins（1971）定义：核型是有丝分裂中期看到的染色体组分的形态。c.Herskowitz（1977）定义：核型是中期染色体或染色体类型按顺序的排列表达。d.李懋学（1995）定义：核型指体细胞染色体在光学显微镜下所有可测定的表型特征的总称。核型分析（Karyotype analysis）：是对核型的各种特征进行定量和定性的表述。核型分析是细胞遗传学（Cytogenetics），染色体工程（Chromosome engineering），基因定位（gene localization）及细胞分类学（cytotaxonomy）

18、等学科的基本研究方法。第一节染色体数目、基数、多倍体及非整倍体一、数目单冠毛菊（Haplopappns gracilis）2n=4，蕨类植物瓶尔小草（Ophioklossum reticulatum）2n=1260 作物大多在2n=10-40，少数如猕猴桃、甘蔗等高达100左右。对具有高染色体数的作物，只宜分析数目变异，不宜做核型分析。原因：a.染色体小。b.可能含有较复杂的多个基因组，难得准确而有价值的结论。c.数目难稳定一致。1、小叶猕猴桃2n=58.2、大籽猕猴桃2n=116。3、京梨猕猴桃2n=116。4、狗枣猕猴桃2n=116观察染色体的细胞数越多，准确性越高，也易发现变异情况

19、，此外，这样才具代表性。全国第一届植物染色体学术讨论会上，约定，计数染色体数目，以30个细胞以上，其中85%以上细胞具恒定一致的染色体数，即可认为是该植物的染色体数目。二、基数与倍性 1.染色体组（Chromosome set）：指二倍体生物的配子体细胞核中的全部染色体，在多倍体生物中则指染色体的组成成分。如小麦单倍体染色体组分由三个染色体组（ABD）组成。每一条染色体是染色体组中不可缺少的成员。 2.染色体基数（chromosome basic number）：指一个二倍体种的单个基因组的数目，在一系列多倍体中，最小的单倍体（monoploid）的染色体数称为基数。常用“x”表示。（一般认为

20、，x>13就属于古多倍体起源）植物配子体的染色体数目，常用“n”表示，二倍体植物的孢子体具两套染色体组，以“2n”表示。示例：一粒小麦（AA）：2n=2x= 14 二粒小麦（AABB）： 2n=4x=28 x=7 普通小麦（AABBDD）：2n=6x=42 金冠苹果：2n=2x=34 湖北海棠：2n=3x=51 x=17小金海棠：2n=4x=68从以上可知：n用于个体发育的范畴，而x用于系统发育的范畴，在作物个体发育的世代交替中，配子体世代称为“n”意即单倍体，孢子体世代称为“2n”即二倍体，它与其真实倍性高低无关。三、多倍体：多倍体包括同源染色体，异源染色体及同源异源染色体。对多倍

21、体做核型分析一般都涉及到其起源演化问题。也就是作出同源异源的判断。但需要注意的就是不要轻易作出同源异源的判断。因为形态相似，并不一定同源。四、非整倍体：某一个体恒定地出现某一同源染色体对中多一个或少一个成员，分别称为三体和单体，多两个或少两个，为四体或缺体。三体或四体可在2x与4x中产生并存活，而单体或缺体，只在多倍体中存活。这类非整倍体在染色体工程与基因定位中有价值，普通小麦已建立了21个单体系列。在一个物种的群体中，某一个或一些个体与其他个体比较，恒定地相差一对或n对非重复的同源染色体时，则可能表明该物种中存在有染色体基数非整倍性变异的个体，称为异整倍体（dysploid）。这是物种分化或

22、新物种产生的标志。也是同属植物中产生多基数的原因。五、混倍体：不同个体与不同细胞间染色体数变化大，出现整倍体与非整倍体无规律变化，称为混倍体。六、B染色体，也称为超数染色体（Supernumerary）指超出某一作物正常染色体数目的一些特殊染色体，如玉米、黑麦、高粱、百合、重楼、蚕豆中常见。区别：1.B染色体均小于正常染色体（也称A染色体），大者不过相当于小A染色体的1/2，小者相当于一个点状小随体大小（可与上述三体、四体区别）2.同一个体中，通常所有细胞中均存在，且数目基本恒定，无论大小，均具有着丝点（中部或端部着丝点），可在体细胞分裂中正常传递（易于与染色体断裂产生的断片区别）3.80%出

23、现在2x植物中，数目多为1-2个，自然界可多达20个。人工诱导或栽培下，可累积达到34个（玉米中发现）。注意：少数存在，不影响植物生长发育，多数存在，引起生活力下降，以及生殖不育障碍。第二节染色体形态和结构一、供核性分析的染色体满足以下条件：1.分裂时期应准确可辨。2.染色体纵面浓缩均匀一致。3.溢痕显示清晰。二、染色体长度1.实际长度（绝对长度）中期染色体变异于1-30um之间。其中裸子植物、石石蒜科禾本科等含较大的染色体，而十字花科、葫芦科、蔷薇科等染色体小。一般以放大的照片测量，实际长度（um）=放大染色体长度（mm）/放大倍数×1000 第一，<1um，微小染色

24、体（其所含基因少，chro-field发育不全）第二，1-4um，小染色体（具有正常的着丝点和端粒，但由于二者距离太近，gene调动的自由度小，相邻基因有很强的相互作用，其染色体场是严密的）第三，4-12um，中等大小染色体（着丝点与端粒间距离适宜，包含有DNA序列的所有类型，易于改变位置，chro-field处于最适宜条件）第四，>12um，大染色体（着丝点与端粒间距离太大，基因移动的自由度大，易于改变位置， chro-field不稳定，处于可塑状态）第三是最适宜基因调控与表达，大多数生物具有这种大小的染色体，这也是自然选择的结果。染色体太大，太小均不利于染色体进化。2.相对长度：=（

25、染色体长度/染色体总长度）×100%优点：排除了染色体浓缩程度不同或个人取用细胞不同而产生的误差。3.臂比：（=长/短臂）或（=短/长：仅在早期文献用）三、着丝点命名及位置1.两点两区系统：Huziwara（1958）即在中部着丝点（m）与端部（t）间三等分，为亚中（sm）和亚端（st）。计算方法：r%=短臂长/染色体全长（=50%：m；=50%-33%：sm；=33%以下：st）此法过于粗放，少有人用。2.四点四区系统：Levan（1964）即在M与T之间，均分四等分，臂比r=L/S命名如下： r M 正中部 1.0 m 中部 1.0-1.7 sm 亚中部 1.71-3.

26、0 st 亚端部 3.01-7.0 t 端部 7.01- T 端部第三节核型分析的操作过程：1. 挑选细胞、摄影、打印、裁剪。2. 目测染色体总长度和着丝点位置，初步进行同源染色体的“人工”配对，用标尺量出每个染色体的长臂、短臂及总长（mm计），然后按总长由长至短顺序排列，并编号（若两对染色体长相等，按短臂排，长者在前）3.求出各对染色体的各项长度平均值，求出r，命名着丝点。4.求出至少5个细胞的上述指标平均值，以此做为参数绘模式图。注意：5个细胞平均值：（1）5个细胞来源于5个不同个体，若作某作物，要选5个以上品种，每一个品种选一细胞。（2）当长度与臂比有冲突时，以臂比为准。.核型参数

27、表及公式序号相对长度% r 着丝点类型 1 0.00 0.00 sm* 具随体 2 3核型公式：2n=4x=36=20m+10sm（2SAT）+4st（2SAT）+2t（SAT）原则：将对称的染色体放于前，其次是不对称，最后是极不对称。6.模式照片及核型图。剪下染色体排在照片下方或右边并编序号。7.核型模式图（idiogram）8.排版：标准版心，长21cm，宽14cm。第四节核型分类对称性核型：指细胞中所有染色体大小相近，都有中部或近中部着丝点染色体。反之，染色体大小差异增大，或染色体臂比值增加，出现st或t型染色体，核型便逐渐变为不对称。根据核型中最长与最短染色体的比值与臂比值两项特征

28、，用以区分。核型分类（stebbins，1971）最长染色体/ 臂比值大于2：1（在染色体组中所占比例）最短染色体 0.0 0.01-0.50 0.51-0.99 1.00 <2:1 1A 2A 3 4A2:1-4:1 1B 2B 3B 4B >4:1 1C 2C 3C 4C表中：1A为最对称，4C为最不对称。目前1C在植物中还未找到。其进化途径：1A-2A-3A-4A-1B-2B-3B-4B-1C-2C-3C-4C如草本多C型，木本多为A、B型，油菜、甘蓝属2B，果树中也多为2B。第四章植物减数分裂制片一、常规的减数分裂压片取材-固定-染色压片-镜检关键是取材，对总状花序、圆锥

29、花序较容易。1.找准物侯期，受气候影响大。2.外部形态指标。简洁方法：1.检测花药颜色，以黄绿色为准（绿色过早，黄色过晚）2.同一花蕾花丝短的较早，花丝长的较晚。3.花瓣在尚未张开的单一花蕾中，减数分裂是同步的。4.压片时，木本植物的胼胝质含量高，需酶解。二、改良涂片法（适合小孢子）1.取材-固定-涂片-Giemsa染色-镜检（1）均要预夹碎。（2）不同作物制片需材量不等。百合科的一个花药可制4-5张片。小麦、黑麦、大麦等2-3条花药制1张片。2.与压片法区别A.分散好，效率高。压片好，可有30个会有分裂相。涂片能达200个以上。B.染色体平态，杂质干扰小。C.操作简单。3.可能机制通过涂散的

30、各个细胞所包含的固定液与冰冻载片上的水膜强烈的亲水作用，再加上火焰与冰片上的冷热骤变，即使细胞破裂，同时核膜内的染色体带着巨大压力迸出，再加上固定液的挥发，致使染色体粘着在载片上。第五章植物染色体分带技术染色体结构变异类型1、缺失2、重复：顺接重复，反接重复，同臂重复，异臂重复，异位重复3、倒位：臂内倒位，臂间倒位4、易位：相互易位，单向易位二、显带机理对染色体的显带机理有多种说法，但都是立足于染色体的化学成分。（1）.DNA的变性和复性 Pardue等人1970年提出DNA分子的变性复性速度影响到C带出现，DNA双螺旋分子，经热碱、酸等处理，其双链分开，变性，而后在盐液中或在降温等“退火

31、”条件下，DNA分子复性，重新结合为双链。在变性复性过程中，异染色质（heterochromatin）较常染色质（euchromatin）复性快些。而Giemsa染料优先与双链DNA结合，故染色快些、深些。（2）染色体中DNA含量或浓缩程度一些学者的试验证明，用酸、碱处理染色体时，从染色体臂上去掉大量常染色质DNA，可能丢失51.9%，而结构异染色质丢失较少，约1.79%。这可能是因为其核苷酸序列是重复排列，高度凝聚，能抗御酸碱作用；故结构异染色质被Giemsa深染。（3）DNA分子的碱基成分一些实验证明，DNA分子中某些区段A-T碱基对较多，它们易于喹丫因或Giemsa染料结合而染成深色

32、带区，即Q与G带。而浅带区段含G-C碱基多。2.蛋白质的作用 G带的产生就是在胰蛋白酶的作用下，蛋白质不均匀丢失的结果。另外也有人认为，染色体经变性或蛋白酶处理后，染色体核蛋白的蛋白质被破坏，这些区段裸露的DNA分子的磷酸基因能与Giemsa染料中的天青和甲基兰等噻嗪类染料结合而染上深色（这种说法待证实）3.多种因素的作用显带是DNA、染料与蛋白质三者之间相互作用的结果，另外，DNA螺旋紧缩程度，结合蛋白的不均匀分布，以及染色单体的局部特点等都可能与显带有关。第二节显带方法1.冷诱导带（Cold induced Banding） Sample Giemsa染色深浅带纹 Negative2

33、.Hy带（Hydro chlorid Banding）盐酸带 1mol/L Hcl + 45%冰乙酸实际上是PH对染色体的一个效应问题。由于染色体为螺旋结构，松紧不一，不易把握度。此外，带数仍较少，带纹特异性差，特征带不明显，实用性差。3.Q带（Quinacrine Bands） sample 荧光液+缓冲液40ml 指甲油封片镜检照相注意：A.1968年Casperson开始，实际上是显带的真正开始。由于这是荧光带，持续性短。 B.染料 a.芥子喹丫因是最早使用的荧光染料，但衰退期太快（2天）。 b.Hochest-33258时间可达一周，灵敏度较高，在松杉科植物的效果最好，全是末

34、端带。 c.DAPI（4，6-二脒基-2苯基吲哚：是目前最好的，灵敏度高，可持续一周多，在许多植物上表现良好）。4.C带：即染色体制片经干燥后，用酸或碱溶液处理（称为变性），再经盐溶液在高温下处理（称为复性），用Giemsa染色。除着丝点外，染色体上其他结构异染色质区也能深染而显带。标本 NaOH 水洗复性60-65 Giemsa染色镜检变性30min （4-5min/次） 1h2×SSC（0.3mol/L NaCl+0.03mol/L 柠檬酸钠）因此，C带的真正含义由着丝点异染色质带（Centromeric heterochromatin bands）的简称而改称为结构异染

35、色质带（constitutive heterochromatin bands） “成熟”。可能是一种缓慢的氧化过程。空气干燥一般需24-48h，若用去壁低渗火焰干燥法制片的一般要3-7天。干燥时间一般1个月以内较可靠，干燥与温度要相对稳定（恒温30-37度或室温下的玻璃干燥皿片干燥一定时间较可靠）。目前，显C带多用Ba（OH）2代替NaOH。Ba（OH）2浓度：大多用5%，少用8%或饱和水溶液。温度：室温 40-50和60。时间：5分钟至30分钟。染色：AGiemsa浓度1-10%，1-2%为淡染法，几小时至几十小时。优点：不会过度，显带精细，节省染料。B. Giemsa浓度5-10%，为

36、浓染法，10-30min，分色较差，且会染色过度。染色时淡染多用染缸，浓染多用扣染。C带优点：带型具有种的特异性和相对稳定，可长期保存和无需荧光显微镜。缺点：不易掌握碱的用量和处理时间机制：酸碱处理，造成蛋白质变性，再经盐溶液下的高温处理，复性而显带。由于随体与着丝点是高度螺旋化区域，最易显带。5.G带（带纹丰富，但缺乏特异性）植物染色体G带主要是我国的一些学者得到的。但是，目前G带均只能在数量上的差异，而带纹数目又随染色体收缩程度不同而改变，其技术还未有根本性的突破。6.N带（只涉及少数染色体）人类染色体制片后，经5%三氯乙酸（TCA）于高温处理后，用Giemsa染色，发现染色体的核仁

37、组成区（随体与短臂之间的部分，NOR：Nucleolar organizing Region）深染，称为N带。20多种植物上有.7.SCE带（姐妹染色体单体互换分染）主要用于各类化学诱变剂对作物诱变的检测，实验证明，诱变剂浓度和处理时间长短，与互换片段的频率呈正相关，该技术也可用于环境中各种诱变因素对植物的影响的检测。8.RE分带（限制性内切酶restriction enzyme） RE在染色体特殊位点酶切，再用Giemsa或荧光染料染色，便在染色体上显示明暗不同的带纹，提供了识别和区分染色体的标志。在哺乳动物中，RE带类似于G和C带；植物中，并不是所有都能诱导。这些酶如EcoRI，Eco

38、RU等。其所显示带纹，比C带数少而更清晰，还有待改进。第三节植物染色体的银染色技术植物染色体分带技术：荧光 Giemsa：C、N、G带其中未包括银染技术。这个技术始于1975年Howell，被称为AS-SAT染色技术，后来确认是18s和28s RNA基因分布区，也就是NOR（核仁组成区）。目前通称为Ag-NOR染色技术。目前，其应用的广度和研究的深度仍与动物和人类染色体的研究相距甚远。其主要原因是植物细胞壁的覆盖使银染色更为困难之故。然而，该技术的不断改进，对植物染色体的研究仍有广泛的前景。第四节带型分析1、分带的模式照片一般应附一张显带清晰而染色体完整的模式照片。2、带型图与一

39、般核型图要求相同，即最好是以模式照片上分带的染色体剪下排成带型图。如果模式照片不完全或不理想，也可不附模式照片，但带型图则是必需的。3、带型模式图先绘制核型模式图，然后在其上标示带纹。一般以横的实线标示带纹的位置和大小，用虚线表示多态带或不稳定的带纹。4、带型公式有5种类型的带纹，均分别以其英文大写字头表示，即C.I.T.N.S。例如，为表示中间和末端带在染色体上的分布，可用“+”号表示。如带纹只分布在短臂上，则在字母的右上角划（I+T+ ）；如带纹只分布在长臂上，则在字母的右下角划（I+T+）；如长短臂上都有带纹，则不表明“+”号。同类型的染色体数目，以符号前的数字表示、不显

40、带的染色体则只以数字表示。例如：黑麦C带的带型公式可以写成： 2n=14=2CT+2CI+2T+6CI + T+2CI +TS（或N）5、描述和统计带纹通常要作数量的统计，大致包括：1）整个细胞所显带纹的总数和总长度。2）不同类型带纹和长度占整个细胞带纹总数和长度的百分比。3）某一特殊染色体带纹数和总长度占整个细胞带纹总数和总长度的百分比。4）整个细胞总带纹长度占所有染色体总长度的百分比。以上的定量统计，对于区分种间带纹的差异以及探讨异染色质与物种演化的关系，都是很有价值的。6、核型分析的计算机软件：系统基本上包括两个部分：染色体图象的前处理；同源染色体配对及绘制核型图。这些系统均需要较贵重

41、和复杂的仪器，目前仍难以普及。第六章染色体显微操作染色体微分析技术包括：染色体显微切割、分离；PCR体外扩增；微克隆技术，染色体或特异区扩增产物间的Southern杂交及特异DNA片段的FISH定位。该项技术是近十多年来随分子生物学技术发展而诞生的一项生物高新技术，它既有细胞生物学的可视性，又有分子生物学的先进性，在染色体结构、基因组和比较基因组学、基因克隆、物理图谱构建等方面具有广泛的应用前景。显微切割技术是在显微状态或显微镜直视下通过显微操作系统对欲选取的材料（组织,细胞群，细胞，细胞内组分或染色体区带等）进行切割分离并收集用于后续研究的技术。显微切割技术实际上属于在微观领域对研究材料的

42、分离收集技术，因此应用此技术往往是许多要深入的研究工作中起始的重要一步。显微切割的特点：一是“细微”，显微切割的对象可以达到微米级，显微切割的精度可以达到毫微米级，因此利用显微切割技术可以分离收集到象核仁和染色体特异区带这样细微的对象；二是“原位”，利用显微切割技术是在组织细胞或染色体的原位取材，因此所取材料的定位清楚，所研究对象的历史背景明确。三是“同质”，显微切割技术可以保证所取材料一定层次上的同质性。四是“结合”，显微切割技术可以与多种分子生物学、免疫学及病理学技术结合使用。显微切割的结合技术能与多种分子生物学、免疫学、遗传学及病理学技术结合应用，使显微切割技术显示出蓬勃的生命力。根据研

43、究的需要可在显微切割前应用组织化学、免疫组织化学、原位杂交、原位末端标记、原位PCR、FISH、组织特染等方法对需要切割的组织内成分进行标记。显微切割后获得的材料可以用于提取蛋白质、DNA和RNA等用于Western Blot、Southern Blot、Northern Blot、PCR等蛋白质和核酸的相关分析。显微切割的影响因素最终结果的因素多种多样。在实验过程中把握一个原则,即一切与显微切割结合的技术中影响因素应同时列为显微切割实验最终结果的影响因素，在实验的过程中予以考虑。与不同的方法结合决定了需要对显微切割的材料进行不同的处理。染色体显微切割技术出现于20世纪80年代。Scalen

44、ghe等（1981）首次报道了应用特殊玻璃针对果蝇唾液腺染色体进行切割、分离和显微克隆。因为当时尚没有发明PCR技术，需分离数百条染色体才可获得足够数量的DNA。 PCR技术发明之后，Lüdecke等（1989）将PCR技术应用到染色体显微切割和克隆中，仅用少量切割片段就获得了足够数量的DNA。自1989年以来，染色体的显微切割技术的研究成果主要是人类染色体区带特异探针池的构建，采用玻璃针法已相继构建了一系列人类染色体区带探针池。时至今日，植物染色体分离技术也已经发展成熟，并成为构建染色体特异区段DNA探针池最为有效和直接的技术手段，例如，应用显微切割技术可以获得长度为13Mb的DN

45、A片段，相当于水稻基因组遗传图谱上13cM。在理论上，遗传标记之间1cM的距离已连锁非常紧密。因此，应用染色体显微切割和分离技术建立特定染色体区段的DNA文库，已成为筛选与基因紧密连锁的分子标记和基因克隆的有效方法之一。染色体显微切割的方法主要有5种：流式细胞分类器法、微细玻璃针法（手工操作法）、激光切割法、玻璃针-激光法和激光捕获微分离法。此外，目前开始尝试使用微操作机器人系统。1、激光切割法此法与手工操作法的主要差别在于：用激光束代替玻璃针，将染色体标本上不需要的片段剔除，然后将剩余染色体片段消化、扩增。Fukui等利用此法成功地切割了植物染色体片段，但是该方法对设备要求较高，激光切割区

46、域对DNA分子也有损伤。2、流式细胞分类器法：流式细胞分类技术分析和分选染色体是分子生物学和遗传学研究的一个非常有效的方法。1983年至1986年，美国的两个实验室用流式细胞分类器和分子生物学技术建立了人类24种染色体特异性的基因文库。也有学者利用此项技术分离了番茄第二号染色体。优缺点使实验过程机械化，可用于处理大批染色体。但结构相似的染色体难以分开，使有些文库中其它染色体污染率高达10-50%，不能构建染色体区带特异性文库。3、玻璃针-激光法由于激光显微切割法需要价格昂贵的特殊培养皿，操作也较复杂。且氩离子激光热效应大，容易对切口附近的染色体DNA造成较大损伤。玻璃针法较为成功，但难以对染色

47、体进行精确的定位切割。王槐等研究了一种由激光微束与玻璃针结合使用来切割分离植物染色体片段的方法。优缺点盖玻片的存在减少了切割过程中外源DNA分子的污染，且为油镜下更准确地识别目的染色体和定位切割靶点创造条件，切割准确；因为用玻璃针分离切割后的染色体，所以用普通载玻片即可进行染色体制备，费用较低；但仍需借助玻璃针的操作，易污染。4、激光捕获微分离法它是一种将紫外激光束切割与激光压力弹射相结合的新方法，激光聚焦点直径小于1um，是目前最为先进的技术，它使染色体显微切割操作步骤大大简化。将超薄膜用胶带封固在干净的载片上，紫外消毒，染色体制片。用激光脉冲将靠近目标染色体的不需要的遗传材料选择去除。围绕

48、目标染色体，用激光脉冲切割薄膜，通过激光压力弹射操作仪将切下的薄膜上的目标染色体弹射到距载玻片小于1mm的收集装置上，如果所需目标染色体数目多且相同，则可收集到同一个收集装置上。优缺点除具有激光微切割的优点之外，还在一种环境中操作，避免了污染；激光波长为337nm，远离DNA最大吸收波长260nm，无热效应产生，不会损坏材料；样品可长时间保存。但仪器及薄膜价格极为昂贵。PALM激光显微切割系统由德国PALM公司研发的一套高级精确的实验室设备。利用337纳米的紫外激光对显微镜下的生物样本（组织，细胞簇，单细胞，染色体，染色体片断等）进行切割和分离。在病理学，遗传学，肿瘤学、植物学等多个科研领域

49、得到非常广泛的应用。5、手工切割法：此法主要步骤包括：a、染色体制备，常规制备的中期染色体即可；b、染色体显微切割，在倒置显微镜下配置显微切割器，并将制备的硅化玻璃针安装在切割器上，把染色体标本置于载物台上，在显微镜下找到待切割染色体标本，操作玻璃针进行切割；c、切取染色体片段进行原位裂解和体外扩增。改进的染色体微分析技术染色体微分析技术就是在对染色体显微切割和分离的基础上建立起来的。因此它的前提是必须对染色体能够准确地识别和精确切割与分离。国内改进了当前普遍应用的倒置显微镜切割的方法，采用了普通透射光学显微镜，用100倍油浸物镜在1000-1500高倍数下，对染色体进行切割和分离，不但对染

50、色体的个体能准确地识别，而且可使切割的精确度达到0.3微米。1.玻璃针的制备2.染色体的微切与分离全细胞染色体的分离特定单条染色体的分离染色体特定区的显微切割微操作机器人系统微操作系统作为MEMS（微机械电气系统(Micro-Electro-Mechanical Systems）研究领域的一个重要分支受到各发达国家的高度重视，纷纷投入大量资金进行微操作机器人系统的研究，现已研制出多种各具特色的微操作机器人实验样机系统。生物工程作为微操作机器人系统的主要应用领域。把生物工程作为微操作机器人的应用领域，目的可以解释为2点：从应用层面说，目标相当明确地界定在“面向生物工程”上，如细胞操作、基因转移

51、、染色体切割等，希望给下一世纪中国的“绿色革命”带来推动作用。从技术层面说，定位在基于显微视觉全局闭环的计算机伺服自动协调作业上。长远观之，其相关技术与微加工、微电子、显微医学等可触类旁通。系统的具体运作方式：活体细胞或染色体悬浮在培养液内，左右微操作机器人对称地安装在显微镜机架上，毛细玻璃管与毛细玻璃针等操作工具作为机器人的末端执行器(毛细玻璃管用于捕捉与固定细胞，毛细玻璃针用于细胞的切割、注射等)。3、扩增产物的原位杂交分析利用荧光原位杂交技术可直接将某个区段的DNA直接定位在染色体上，进行PCR产物的鉴定。同时还可以将某个区段DNA定位到相关的其它植物染色体上，进行染色体“一对一”的杂交

52、和进行单条染色体之间的比较作图研究。4、单条染色体AFLP分子标记图谱分析单条染色体AFLP分子标记图谱分析，可以直接获得任意一种植物特定染色体分子标记图谱，利用这些相同的DNA分子标记，在相关的物种之间进行遗传或物理作图，比较这些标记在不同物种基因组中的分布特点，揭示染色体或染色体片段上基因及排列顺序的相同或相似性，并由此对相关物种的基因结构和起源进行分析，为基因的克隆、基因组的比较研究、遗传图谱和物理图的构建提供一个新的方法。单条染色体AFLP技术存在的问题单条染色体DNA模板含量较低，为扩增增添了不稳定因素染色体标本制备及分离过程中可能会对DNA造成损伤植物染色体原位杂交技术原位杂交In

53、 situ hybridization，简称ISH，也称作杂交组织化学或细胞学的杂交，是一种能够从形态学上证明特异性的DNA或RNA序列存在于个别细胞、组织部分，单细胞或染色体中的技术，是分子生物学和组织化学、细胞学结合的产物。原位杂交技术是从Southern和Northern杂交技术衍生而来，包括染色体原位杂交和RNA原位杂交，其基本原理是：含有互补顺序的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内的DNA或RNA形成稳定的杂交体。染色体原位杂交技术是根据核酸分子碱基互补配对的原则(AT，GC)，将有放射性和非放射性标记的探针与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对，结合成专一的核

54、酸杂交分子，再经过一定的检测手段将待测核酸在染色体上的位置显示出来。原位杂交技术主要方法一、荧光原位杂交二、基因组原位杂交三、原位PCR四、引物原位杂交技术五、原位杂交结合显带标记技术六、原位杂交结合免疫组织化学的双标记技术七、电镜原位杂交技术八、整体荧光原位杂交技术九、DNA纤维荧光原位杂交 fiber-FISH一、荧光原位杂交(Fluorescence in situ Hybridization) 是原位杂交技术大家族中的一员，因其所用探针被荧光物质标记（间接或直接）而得名，基本原理是荧光标记的核酸探针在变性后与已变性的靶核酸在退火温度下复性；通过显微镜观察荧光信号可在不改变被分析对象（即维持其原位）的前提下对靶核酸进行分析。DNA荧光标记探针是其中最常用的一类核酸探针。利用此探针可对组织、细胞或染色体中的DNA进行染色体及基因水平的分析。二、基因组原位杂交基因组原位杂交是在分子水平上检测外源染色质的一种有效方法,其探针是总基因组DNA.该技术广泛应用于植物进化和亲缘关系的鉴定上。三、原位PCR原位PCR技术的基本原理，就是将PCR技术的高效扩增与原位杂交的细胞定位结合起来，从而在组织细胞原位检测单拷贝或低拷贝的特定的DNA或RNA序列。原位PCR技术的待检标本一般先经化学固定，以保持组织细胞的良好形态结构。细