一株高产表面活性素基因工程解淀粉芽孢杆菌的构建及发酵优化

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目录

第一章 绪论

1.1 前言

1.2 生物表面活性素surfactin概述

1.3 surfactin的应用

1.4 surfactin的生物合成及代谢调控

1.4.1 surfactin的生物合成

1.4.2 surfactin合成的调控机制

1.5 surfactin的高产策略

1.5.1 诱变育种

1.5.2 基因工程改造

1.5.3 发酵优化及降低生产成本

1.6 研究意义及研究内容

第二章 CPLK1314突变体库的构建及高产surfactin突变株的筛选

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.2.1 供试菌株、质粒与培养基

2.2.2 主要试剂和仪器

2.2.3 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314随机插入突变体库的构建

2.2.4 抑制金黄色葡萄球菌效果变化显著突变株的筛选

2.2.5 反向PCR获取突变体转座子侧翼序列

2.3 结果与讨论

2.3.1 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314突变体库的构建

2.3.2 CPLK1314突变株对金黄色葡萄球菌的抑菌活性测定

2.3.3 转座子TnYLB-1插入位点基因的反向PCR克隆

2.3.4 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314的LC-MS分析

2.3.5 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314及突变株的高效色谱分析

2.4 讨论与小结

第三章 转录组分析高产分子机制

3.1 前言

3.2 实验材料与方法

3.2.1 菌株和质粒

3.2.2 采用 RNA-seq 进行转录组分析

3.2.3 RT-PCR和qRT-RCR分析

3.2.4 基因富集

3.2.5 构建KEGG路径

3.3 结果与讨论

3.3.1 CPLK1314 菌株和突变株 △GltB 的转录特征分析

3.3.2 CPLK1314菌株和突变株△GltB的代谢组分析

3.3.3 从头构建 B. amyloliquefaciens突变株△GltB生物合成surfactin的KEGG途径

3.3.4 Surfactin 的合成酶基因

3.4 本章小结

第四章 高产surfactin工程菌株的构建

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.2.1 供试菌株、质粒与培养基

4.2.2 抗生素

4.2.3 主要实验仪器

4.2.4 实验试剂

4.2.5 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314基因组DNA 的提取

4.2.6 质粒DNA的提取

4.2.7 重组载体的构建

4.2.9 突变体菌株的构建

4.2.10 CPLK1314 菌株及其突变株抗细菌活性的测定

4.2.11 突变株的溶血活性

4.2.12 解淀粉芽孢杆菌CPLK1314和其突变株发酵产surfactin的定性定量分析

4.3 结果与讨论

4.3.1 CPLK1314基因组DNA电泳验证

4.3.2 重组敲除载体pMUTIN4SerA的构建

4.3.3 重组敲除载体pUCSCRapF的构建

4.3.4 重组表达载体pTC-placI-T1T2-YbdT的构建

4.3.5 重组表达载体pTN-psrf T1T2-SrfAD的构建

4.3.6 突变株PCR电泳验证

4.3.7 突变株抗细菌活性的测定

4.3.8 突变株的溶血活性

4.3.9 菌株产脂肽类抗生素能力检测结果

4.4 本章小结

第五章 重组解淀粉芽孢杆菌发酵工艺优化

5.1 前言

5.2 实验材料与方法

5.2.1 实验菌株

5.2.2 培养方法

5.2.3 单因素实验

5.2.4 CPLK1314菌株及其突变株发酵产surfactin响应面法优化试验

5.2.5 溶血活性的测定

5.3 结果与分析

5.3.1 野生型菌株CPLK1314及其突变株发酵产surfactin单因素试验结果

5.3.2 野生型菌株CPLK1314及其突变株发酵产surfactin响应面优化试验结果

5.3.3 CPLK1314菌株及其突变株溶血活性的测定

5.4 小结

第六章 结论与展望

参考文献

致谢

附录: 攻读硕士学位期间取得的研究成果

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