Adv Sci（IF:14.3）丨项目文章：大丽轮枝菌引发的植物免疫机制解析

动物被微生物侵扰会产生免疫应答反应，那么植物呢？植物没有完善的循环系统，不能自由活动，那它的免疫反应是如何进行的呢？

Jones and DangI 根据研究进展，总结出植物与病原体互作模式，被称为植物病理学的“中心法则”，它将植物和病原体间的互作分为两层防御系统。第一层防御系统统称为病原相关分析模式触发的免疫反应（PTI）, PTI相对温和且容易被病原菌分泌的毒性蛋白所抑制或突破,类似于动物的天然免疫，然而病原菌进化出一些能抑制PTI发生的机制，例如通过编码效应因子（效应蛋白、毒性蛋白）抑制基础免疫响应PTI；针对这一情况，植物继续进化，产生了第二道防线，依赖于植物特定效应子受体（NLRs）蛋白识别病原菌分泌的毒性蛋白，引起专化性抗性（ETI），该防线反应强烈且能赋予植物强抗病性。两层免疫系统并不是独立发挥作用，而是相互方法协同，以保障植物获得持久强烈的免疫效应。

大丽轮枝菌是一种土壤传播的真菌，能够感染多种植物并导致毁灭性的黄萎病。植物和大丽轮枝菌之间的免疫识别机制仍不清楚。

2024年11月3日，中国科学院微生物研究所张杰团队在Advanced Science（IF:14.3） 杂志发表题为：Recognition of a Fungal Effector Potentiates Pathogen-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Cotton的研究论文。该研究通过正向遗传学方法，筛选出一个大丽轮枝菌的分泌蛋白VdEPD1，该蛋白能触发烟草和棉花的免疫防御反应，该研究还发现其触发的ETI和PTI之间存在的协同作用。青莲百奥为该研究提供磷酸化鉴定服务。

研究亮点

发现并验证了V. dahliae的一个分泌蛋白VdEPD1可作为一种诱导物，在烟草和棉花植物中触发防御反应。

筛选并验证了植物受体蛋白，阐述了烟草和棉花植物对VdEPD1的识别和触发免疫（PTI）机制。

揭示了植物受体蛋白的磷酸化修饰在植物抗病中的作用。

研究结果

一、大丽轮枝菌T-DNA插入突变体在棉花植株中具有较强的致病性

为了鉴定植物识别并能够触发免疫的大丽弧菌诱导物，该研究通过遗传筛选，分离出在棉中具有增强致病性的大丽弧菌突变体，筛选出了关键蛋白VdEPD1。

为了确定导致致病性增强的突变体，使用T-DNA插入突变体库进行筛选，WB结果显示，在VDAG_01961和VDAG_01962（VdEPD1）编码序列之间，有一个单一的VDAG_01961整合到V592基因组区域。接下来检测了T4915突变体和WT菌株V592中VDAG_01961和VdEPD1的表达水平，发现与V592菌株相比，T4915突变体中VdEPD1下调，而VDAG_01961没有下调。

图1 大丽花T-DNA插入突变体在棉花植株中具有较强的致病性

二、VdEPD1的缺失增强了大丽花弧菌的致病性

为了研究T4915的致病性是否与VdEPD1下调有关，通过同源重组生成Vd∆01962（VDAG_01962缺失，称为Vd∆epd1）和Vd∆01961（VDAG_01961缺失），发现与V592相比，Vd∆epd1突变体和Vd∆01961突变体表现出增强的毒力。

为了验证T4915突变体的致病性增强是否与VdEPD1的下调有关，随后将VdEPD1的基因组编码区引入T4915突变体，生成一个新的菌株T4915/VdEPD1。该菌株的致病性与野生株相同，这表明VdEPD1下调导致T4915突变体的致病性增加。然后检测了早期感染过程中VdEPD1在不同阶段的表达。结果显示，VdEPD1在棉花根系潜伏期开始12小时后显著上调，在72小时达到峰值。这些结果表明，VdEPD1的下调与T4915突变体的致病性增强之间存在因果关系。

图2 VdEPD1的缺失增强了大丽花弧菌的致病性

三、VdEPD1在植物中作为一种效应器和诱导细胞死亡和防御反应

为了研究VdEPD1引起的植物免疫反应，该研究通过农杆菌介导的转化，在本氏烟草叶片中短暂表达VdEPD1。与预期的一样，VdEPD1的瞬时表达诱导了本氏杆菌和海岛棉的细胞死亡。

为了确定VdEPD1中负责诱导细胞死亡的核心结构域，构建了携带不同基因的载体 (VdEPD1-1, VdEPD1-2, VdEPD1-3,和 VdEPD1），并在本氏杆菌中表达。结果显示本氏杆菌需要全长的VdEPD1，而不是其他片段，则可触发其细胞死亡，这表明VdEPD1需要全长蛋白来诱导其细胞死亡。同时证明了VdEPD1瞬时表达后促进防御相关基因的表达和ROS的积累，表明VdEPD1在植物中引发免疫反应。

许多触发植物NLR介导免疫的诱导子都是分泌蛋白。利用基于自组装分裂纳米萤光素酶（NanoLuc）的测定来检测VdEPD1的分泌。结果表明，VdEPD1是一种由大丽花通过非典型途径传递并转移到植物细胞中的分泌蛋白。

图3 VdEPD1在植物中作为一种诱导细胞死亡和防御反应的效应物

四、vdepd1诱导的本氏杆菌细胞死亡需要NbS00058880g0009（ NbEIR ）

为了探索本氏杆菌中负责识别VdEPD1的成分，对农杆菌叶片进行了转录组测序，筛选出了关键基因NbS00058880g0009（ NbEIR ）。

研究中筛选了27个在VdEPD1样本转录中上调10倍的蛋白相关激酶进行进一步分析。将这些基因的病毒诱导基因沉默（VIGS）载体的农杆菌分别用pTRV1转到本氏杆菌植株中。发现NbS00058880g0009的沉默特异性显著降低了VdEPD1诱导的细胞死亡。分裂荧光素酶试验结果表明VdEPD1与NbS00058880g0009（ NbEIR ）相互作用，且这个相互作用对于VdEPD1诱导的细胞死亡是必需的。

图4 NbS00058880g0009与VdEPD1结合，是VdEPD1诱导的本氏杆菌细胞死亡所必需的

五、GbEIR5A/D是海岛棉对大丽轮枝菌的抗性所必需的

为了探索VdEPD1在棉花中的识别机制，以及NbEIR蛋白在其中的作用，研究者基于序列相似性筛选出NbEIR在海岛棉（G. barbadense）中的同源蛋白，并命名为GbEIR1至GbEIR5D。通过分裂荧光素酶互补实验发现这几种GbEIR蛋白与VdEPD1有相互作用。随后构建相对应的基因沉默载体。其中，沉默GbEIR5A和GbEIR5D的棉花植株（GbEIR5A/D）表现出增强的病害症状。因此，GbEIR5A/D是海岛棉对大丽轮枝菌的抗性所必需的。

图5 GbEIR5A/D与VdEPD1结合，并有助于VdEPD1触发的防御

六、GbEIR5A的磷酸化及其在抗病性中的作用

磷酸化在植物受体样细胞质激酶中调节信号转导和细胞活性中起着至关重要的作用。通过λ蛋白磷酸酶（PPase）处理降低GbEIR5A的迁移率，表明GbEIR5A经历了磷酸化修饰。通过质谱分析鉴定了GbEIR5A的潜在磷酸化位点，包括Tyr165, Tyr167, Ser172, Ser219, Ser225, Ser291, 和 Ser421。突变这些位点后进行迁移率变化实验，发现Tyr165和Tyr167对于GbEIR5A的磷酸化至关重要。在棉花子叶中表达GbEIR5A及其磷酸化位点突变体，并检测了GbPR5和GbPR16的表达，发现Tyr165和Tyr167对于棉花抗病性相关基因的表达至关重要。

图6 GbEIR5A磷酸化调控抗性相关基因的表达

七、VdEPD1增强GbEIR5A/D的表达，增强PTI

该研究发现GbEIR5A和GbEIR5D不仅参与了对VdEPD1的ETI，还参与了对PAMPs的PTI，并且ETI能够增强PTI的效果，揭示了棉花中这两种免疫反应之间存在协同作用。

通过使用携带pCambia1300-35S-VdEPD1-FLAG的农杆菌（Agrobacterium）接种棉花子叶，发现VdEPD1显著诱导了GbEIR5A/D的表达，表明VdEPD1能够上调这两个基因的转录水平。在沉默GbEIR5A/D的棉花植株中接种携带VdEPD1的农杆菌，结果表明沉默GbEIR5A/D损害了VdEPD1诱导的细胞死亡，暗示GbEIR5A和GbEIR5D参与了VdEPD1诱导的ETI（效应子触发免疫）。过表达GbEIR5A和GbEIR5D进一步增强了几丁质诱导的ROS产生，表明GbEIR5A和GbEIR5D对PTI（病原相关分子模式触发的免疫）有积极贡献。VdEPD1的过表达还显著增强了PTI响应基因如GbMPK3和GbBAK1的表达。此外，GbEIR5A/D与拟南芥中的RIPK蛋白序列具有高度相似性，在VdEPD1触发的防御中具有相似的作用。

图7 VdEPD1增强GbEIR5A/D，增强棉花PTI

研究结论

该研究揭示了棉花对大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）的免疫识别机制，特别是VdEPD1这一真菌效应蛋白在植物免疫中的作用。研究发现，VdEPD1能够触发棉花中的防御反应，包括活性氧种（ROS）的积累和细胞死亡。研究还发现，棉花中的GbEIR5A和GbEIR5D受体样蛋白激酶与VdEPD1相互作用，参与效应子触发的免疫（ETI）。此外，VdEPD1能够增强棉花对病原相关分子模式（PAMPs）的免疫反应，即PAMP触发的免疫（PTI），表明ETI和PTI之间存在协同作用。这些发现不仅增进了对植物与病原体相互作用中分子机制的理解，也为培育抗病害作物提供了潜在的分子靶标。

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【参考文献】

[1] Jones, J., Dangl, J. The plant immune system. Nature 444, 323–329 (2006).

[2] Sun L, Li X, Zhong J, et al. Recognition of a Fungal Effector Potentiates Pathogen-Associated Molecular Pattern-Triggered Immunity in Cotton. Adv Sci (Weinh). Published online November 3, 2024. doi:10.1002/advs.202407787

青莲百奥合作文章

青莲百奥深度参与众多前沿研究，与中国医学科学院、中国科学院、军事医学研究院、国家蛋白质科学中心、四川大学华西医院等单位通力合作，累计发表SCI论文100余篇，累计影响因子（IF）1000+，多项重磅文章问鼎Nature、Science Translational Medicine、Nature Communications等顶级期刊。

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