干扰素诱导蛋白IFIT5调控鸭甲肝病毒天然免疫反应的作用机制研究

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目录

摘要

英文摘要

1前言

1．1DHV概述

1．1．1DVH临床表现及病理变化

1．1．2DHAV-l致病性

1．1．3DHAV流行病学

1．1．4DHAV培养特性

1．1．5DVH的预防

1．1．6DVH与细胞活动的关系

1．2IFN-I信号通路概述

1．2．1模式识别受体

1．2．2干扰素产生的信号转导过程

1．2．3干扰素刺激基因

1．3干扰素诱导蛋白IFITs研究进展

1．3．1IFIT的基本特征

1．3．2IFITs的结构特征

1．3．3IFITs表达的动力学特征

1．3．4IFITs的功能研究

1．4研究的目的与意义

2材料与方法

2．1试验材料

2．1．1细胞系、毒株和实验动物

2．1．2质粒和菌株

2．1．3主要试剂

2．1．4抗体

2．1．5试验仪器及设备

2．1．6主要溶液试剂制备

2．2试验方法

2．2．1细胞培养

2．2．2质粒构建

2．2．3小干扰RNA

2．2．4截短体的构建

2．2．5总RNA提取及反转录

2．2．6PCR产物的纯化

2．2．7感受态细胞制备

2．2．8重组表达载体的构建

2．2．9重组表达载体的转化及鉴定

2．2．10重组表达载体的质粒提取

2．2．11重组蛋白的诱导表达

2．2．12细胞转染

2．2．13病毒感染

2．2．14实时荧光定量PCR

2．2．15TCID50的测定

2．2．16SDS-PAGE配置

2．2．17Western blot配置

2．2．18免疫共沉淀

2．2．19免疫荧光染色

2．2．20蛋白纯化

2．2．21Ni柱柱再生

2．2．22蛋白浓度测定

2．2．23多克隆抗体的制备

2．2．24酶联免疫吸附测定试验

2．2．25非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．2．26核质分离试验

2．2．27双萤光素报告酶基因试验

2．2．28数据分析

3试验结果

3．1鸭源IFIT5的克隆及真核表达载体的构建

3．2DHAV-1诱导产生IFIT5

3．3IFIT5过表达抑制IFN-I信号通路

3．3．2IFIT5在DEF中抑制ISGs和IFN mRNA水平

3．3．3IFIT5过表达促进DHAV-1病毒复制

3．4IFIT5沉默有利于IFN-I信号通路

3．4．1IFIT5沉默促进IFN-β和ISRE启动子活性

3．4．2IFIT5沉默抑制DHAV-1病毒复制

3．5IFIT5通过靶向IRF7抑制IFN-I信号通路

3．6IFIT5与IRF7直接相互作用

3．6．1IFIT5和IRF7的多克隆抗体的制备

3．6．2IFIT5与IRF7之间相互作用存在共定位

3．6．3IRF7Subdomain Ⅲ结构域对IFIT5-IRF7相互作用至关重要

3．7IFIT5抑制IRF7二聚化及核转移

4讨论

5结论

参考文献

致谢

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