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‘正午’牡丹核型分析及减数分裂的染色体行为观察

来源：花匠小妙招时间：2024-11-27 14:22

牡丹（Paeonia sect. Moutan）是我国特产的传统名花，经过1 600多年的人工栽培选育，栽培牡丹的性状与野生种相比发生了巨大改变，而种间杂交是导致这种改变的重要原因之一[1-4]。中国传统观赏牡丹（P. suffruticosa）的不断改良，主要得益于牡丹组革质花盘亚组内近缘种之间的杂交[5]，而肉质花盘亚组远缘种滇牡丹（P. delavayi）参与的亚组间远缘杂交则实现了牡丹花色等重要性状育种的突破，并逐渐成为牡丹育种的主要发展方向[6]。亚组间远缘杂交难以获得杂交F1代，为数不多的杂种F1高度不育，极大地限制了其性状的进一步改良[7-9]。‘正午’牡丹（P. × lemoinei ‘High Noon’）是美国著名育种家Sunders于1952年育出的一个开黄花的亚组间杂种（P. delavayi × P. suffruticosa），其观赏性状好、适应能力强，曾获美国牡丹芍药协会金奖，并在全世界得到广泛栽培[7-8]。‘正午’牡丹具有形态比较正常的雌蕊和雄蕊，但其天然授粉结实率极低，仅为0.005 3% ~ 0.013 0%；其花粉大多形态异常、极难萌发，表现出典型的高度不育性[10]。然而，‘正午’牡丹在与其他牡丹杂交过程中，不管作为父本还是母本，均能偶尔得到杂交后代[11-12]，而且杂种表现出较好的观赏性状[11]，显示其仍具有一定的育种价值。减数分裂过程中的染色体行为是影响配子形成和育性的关键。‘正午’牡丹的花粉形态、授粉及受精过程、胚囊及胚乳的发育、胚珠的败育等有性生殖环节均有研究[10]，但其减数分裂过程仍不清楚。本研究观察并分析了‘正午’牡丹体细胞核型及花粉母细胞减数分裂过程中的染色体行为，初步揭示了其育性极低的细胞遗传学机制，为‘正午’及类似亚组间杂种在牡丹杂交育种中的利用提供一定的参考。

1. 材料与方法

1.1 核型分析

2017 — 2018年从北京林业大学鹫峰牡丹研究基地栽培的‘正午’牡丹成年植株上取直径约1 cm花蕾的幼嫩雌蕊，对二氯苯-α溴奈混合液4 ℃预处理8 ~ 12 h，卡诺固定液（无水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1）4 ℃固定24 h；蒸馏水冲洗数次，转移到70%酒精中保存；用 1 mol/L HCl溶液在60 ℃的水浴解离8 ~ 10 min；蒸馏水冲洗后，卡宝品红染色，压片法制片，显微镜下观察并拍照。选取5个染色体分散良好且着丝点清晰的细胞标本照片，在制图软件CAD中量取每个染色体的长短臂，根据参考文献[13]的标准进行核型分析。

1.2 减数分裂观察

春季4月底至5月初花前采摘‘正午’牡丹花蕾，在无水乙醇∶冰醋酸 = 3∶1的固定液中固定，然后放置于70%的酒精溶液中在4 ℃的条件下低温保存。采用压片法制片，从保存液中取出花蕾，用镊子摘取长度为4 ~ 6 mm的花药，放置于载玻片中央，滴加一滴卡宝品红染液，用镊子和解剖针剖开花药，将其中的小孢子母细胞挤出，去除杂质，盖上盖玻片并压片，在显微镜下观察并拍照。

2. 结果与分析

2.1 ‘正午’牡丹的核型

‘正午’牡丹为二倍体，核型公式为2n = 2x = 10 = 7m + 1sm + 2st（1SAT）（表1）。10条染色体按长度排序后，相邻的一对染色体长度接近，但臂比值差异均较大（表1、图1），呈现出高度的杂合性，因此将每条染色体单独进行编号。第8号染色体臂比为1.71，属于近中部着丝点（sm）染色体[13]，与其他所有染色体均有明显区别，第10号染色体短臂末端有一个清晰可见的随体（图1）。

表 1 ‘正午’牡丹核型数据

Table 1. Karyotype parameters of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’

染色体序号
Chromosome No.相对长度
Relative length/%臂比
Arm ratio染色体类型
Chromosome type 1 11.77 ± 0.53 1.40 ± 0.05 m 2 11.48 ± 0.53 1.17 ± 0.09 m 3 10.94 ± 0.52 1.16 ± 0.08 m 4 10.65 ± 0.23 1.52 ± 0.13 m 5 10.25 ± 0.34 1.39 ± 0.10 m 6 10.09 ± 0.24 1.15 ± 0.11 m 7 9.59 ± 0.29 1.23 ± 0.21 m 8 9.37 ± 0.47 1.71 ± 0.24 sm 9 8.27 ± 0.59 4.39 ± 0.37 st 10 7.58 ± 0.42 3.53 ± 0.17 st* 注：*随体染色体，随体长度未计算在染色体长度内。Note: * represents sat-chromosome, the length of satellite was not included.

图 1 ‘正午’牡丹中期染色体及核型

Figure 1. Metaphase chromosomes and karyotype of Paeonia × lemoinei ‘High Noon’

2.2 减数分裂过程及染色体行为异常

‘正午’牡丹的花粉母细胞可通过正常的减数分裂形成四分体及小孢子（图2）。中期I可形成5个整齐排列的二价体；后期I二价体分离，各有5条染色体移向两极，在末期I不发生胞质分裂；中期II两个子核的染色体分别重新整齐排列于细胞中部，然后姐妹染色单体发生分离，进而产生4个子核，并形成四分体。然而，减数分裂过程中大部分细胞呈现出各种各样的染色体行为异常。

图 2 ‘正午’牡丹花粉母细胞的正常减数分裂过程

a：中期I，5个整齐排列的棒状二价体；b、c：后期I；d：末期I；e：中期II；f：后期II；g：末期II；h：四分体时期。 a, metaphase I with 5 rod bivalents orderly arranged; b,c, anaphase I; d, telophase I; e, metaphase II; f, anaphase II; g, telophase II; h, tetrad.

Figure 2. Regular meiosis of pollen mother cells in Paeonia × lemoinei ‘High Noon’

中期I除了极少数细胞形成5个二价体外，更多的细胞形成不同数量的单价体及多价体（图3），表明其染色体联会及配对过程出现较多的紊乱。后期I及末期I也表现出大量的染色体异常行为，包括染色体桥、断片、落后染色体、不等分离等，有的细胞中多种异常同时存在（图4）。减数第一次分裂中约有70%的花粉母细胞发生染色体行为异常，其中染色体桥最为常见。

图 3 减数第一次分裂中期的异常

a ~ e：4个二价体 + 2个单价体（a、e：4个棒状二价体 + 2个单价体，b ~ d：3个棒状二价体 + 1个环形二价体 + 2个单价体）；f ~ j：3个二价体 + 4个单价体；k、l：2个二价体 + 6个单价体（k：棒状二价体 + 环形二价体 + 6个单价体，l：2个棒状二价体 + 6个单价体）；m：1个二价体 + 8个单价体；n：1个二价体 + 1个三价体 + 5个单价体；o：2个二价体 + 1个三价体 + 3个单价体；p：3个二价体 + 1个三价体 + 1个单价体；q：1个二价体 + 1个七价体 + 1个单价体；r：1个二价体 + 1个五价体 + 3个单价体 + 1个断片；s：1个五价体 + 5个单价体；t：1个六价体 + 4个单价体。a−e, 4 bivalents + 2 univalents (a, e, 4 rod bivalents + 2 univalents, b−d, 3 rod bivalents + 1 ring bivalent + 2 univalents); f−j, 3 bivalents + 4 univalents; k−l, 2 bivalents + 6 univalents (k, rod bivalent + ring bivalent + 6 univalents; l, 2 bivalents + 6 univalents); m, 1 bivalent + 8 univalents; n, 1 bivalent + 1 trivalent + 5 univalents; o, 2 bivalents + 1 trivalent + 3 univalents; p, 3 bivalents + 1 trivalent + 1 univalent; q, 1 bivalent + 1 heptavalent + 1 univalent; r, 1 bivalent + 1 quinquevalent + 3 univalents + 1 fragment; s, 1 quinquevalent + 5 univalents; t, 1 hexavalent + 4 univalents.

Figure 3. Meiotic abnormalities in metaphase I

图 4 减数第一次分裂后期到末期的异常

a ~ c：有染色体桥，无断片；d ~ g：有染色体桥及1 ~ 6个断片；h、i：染色体双桥及断片；j ~ l：染色体桥和落后染色体；m：末期染色体桥及断片；n ~ s：无染色体桥，有落后染色体及断片；t：染色体不等分离；u ~ x：不等分离、染色体桥、落后染色体及断片同时存在。a−c, chromosome bridge with no fragment; d−g, chromosome bridge with 1−6 fragments; h−i, chromosome double bridge with fragments; j−l, chromosome bridge with lagging chromosome; m, chromosome bridge with fragment in telophase I; n−s, lagging chromosome and fragment with no chromosome bridge; t, unequal segregation of chromosomes; u−x, unequal segregation of chromosomes with chromosome bridge, lagging chromosome and fragment.

Figure 4. Meiotic abnormalities in anaphase I and telophase I

减数第二次分裂中，染色体的异常行为依然普遍，异常率同样高达70%。中期II纺锤体呈现不同的定位方式，形成直线纺锤体、垂直纺锤体、三极纺锤体、融合纺锤体、平行纺锤体等多种类型（图5a ~ f）。末期II除了正常形成4个子核外，还出现2个核及3个核现象，进而形成二分体及三分体。此外，在后期II及末期II中还出现染色体桥、断片及落后染色体（图5g、h、l、n、p）等异常现象，并最终在一些小孢子中形成微核或出现特小的额外小孢子（图5x）。

图 5 减数第二次分裂的异常

a ~ f：中期II的不同纺锤体定位（a：直线纺锤体，b：垂直纺锤体，c、d：三极纺锤体，e：融合纺锤体，f：平行纺锤体）；g ~ n：减II后期的异常（g：染色体桥，h：对角线桥，i、j：三极纺锤体后期形成的2组减数染色体及1组未减数染色体，k：融合纺锤体后期形成的2组未减数染色体，l：4组染色体及额外染色体，m：后期II的不同步性，形成2组减数染色体及1组未减数染色体，n：后期II的对角线桥及染色体断片）；o ~ t：末期II的异常（o、p、s：2个减数核和1个未减数核，p：3个核及染色体桥、断片，q：2个未减数核，r：4个核及2个微核，t：末期对角线桥）；u：三分体；v：三分体和微核；w：二分体；x：2个正常小孢子、1个具微核的小孢子和1个特小的小孢子。a−f, aspects of meiotic spindles at metaphase II (a, linear spindle, b, perpendicular spindle, c−d, tripolar spindle, e, fused spindle, f, parallel spindle); g−n, meiotic abnormalities in anaphase II (g, chromosome bridge, h, chromosome diagonal bridge, i−j, 2 groups of reduced chromosomes and 1 group of unreduced chromosomes come from the tripolar spindles, k, 2 groups of unreduced chromosomes come from the fused spindles, l, 4 groups of chromosomes with extra chromosomes, m, 2 groups of reduced chromosomes and 1 group of unreduced chromosomes because of the asynchronized anaphase II, n, chromosome diagonal bridge and fragment in anaphase II); o−t, meiotic abnormalities in telophase II (o, p, s, 2 reduced nucleuses and 1unreduced nucleus, p, 3 nucleuses with chromosome bridge and fragment, q, 2 unreduced nucleuses, r, 4 nucleuses with 2 micronucleuses, t, diagonal bridge in telophase II); u, triad; v, triad with micronucleus; w, dyad; x, 2 regular microspores, 1 microspore with micronucleus and 1 extra small microspore.

Figure 5. Meiotic abnormalities in the second meiotic division

3. 结论与讨论

3.1 ‘正午’核型的特点

‘正午’牡丹的核型表现出较高的杂合性（表1），表明其亲本的染色体组在形态上存在一定差异。‘正午’是牡丹（P. suffruticosa）和滇牡丹（P. delavayi）远缘杂交的后代，但其父母本的具体品种或居群没有记载。牡丹的核型主要有2n = 2x = 10 = 8m + 2st和2n = 2x = 10 = 6m + 2sm + 2st两种，极少数为2n = 2x = 10 = 8m + 2sm[14-15]；而滇牡丹除了2n = 2x = 10 = 6m + 2sm + 2st外，还有2n = 2x = 10 = 7m + 1sm + 2st、2n = 2x = 10 = 5m + 2sm + 3st等杂合的核型[16]，二者的核型在种内均呈现一定的多样性，但两个物种的染色体组均存在较多形态相近的染色体。随体是植物染色体的重要形态特征之一，本研究发现‘正午’第10号染色体短臂上存在一个随体。牡丹组植物随体的数量和位置除了与种和品种有关外，还与染色体浓缩程度及制片技术有关，在用于核型分析及染色体识别时存在较高的不稳定性[15]。因此，由于父母本染色体形态标记的不足，在异源杂种‘正午’中，来自两个亲本物种的染色体组难以依据形态特征进行区分，其精确的核型分析需要未来借助原位杂交等技术进行染色体组的识别[17]。

3.2 ‘正午’育性极低的染色体行为机制

染色体的异常行为在‘正午’牡丹减数分裂过程中十分普遍。减I中期普遍存在的单价体和多价体可能导致相当一部分细胞中的同源染色体不能准确地分配到两极，从而造成染色体的重复或缺失；减I和减II中染色体桥和断片的大量存在意味着染色体结构变异也十分普遍，染色体片段的缺失也会导致不能形成可育的配子。类似的染色体结构变异在亚组间杂种牡丹‘Argosy’中也普遍存在[18]。同为亚组间杂种的‘梦幻’为混倍体，体细胞染色体数为9 ~ 15条不等，其减数分裂中的染色体行为则更为混乱，几乎完全不能完成减数分裂过程，呈现完全不育的状态[19]。整体而言，亚组间杂种牡丹的减数分裂异常情况较野生种和亚组内杂种牡丹更复杂[20-23]，这可能是导致其育性降低的主要原因。尽管如此，‘正午’仍有一小部分花粉母细胞能够经过正常的减数分裂过程，形成正常的四分体及小孢子，表现出一定的可育性。

3.3 ‘正午’2n配子的发生途径及潜在价值

除了能够形成一定数量的正常减数配子外，本研究还观察到‘正午’牡丹可以通过二分体及三分体的形成，产生未减数的2n配子。二分体的发生可能是中期II具有融合纺锤体的细胞继续分裂的结果（图5 e）。三分体的出现可能与三极纺锤体的产生（图5 i、j）及直线纺锤体的不同步分裂（图5 m）有关。其中，融合纺锤体和三极纺锤体形成的2n配子在染色体组成上是类似的，为减数第一次分裂复原型（FDR）；而直线纺锤体的不同步分裂形成的2n配子为减数第二次分裂复原型（SDR）[24-25]。牡丹组所有种均为二倍体[26]，除‘首案红’是三倍体外，所有检测过染色体数目的品种也均为二倍体[14-15,27-29]。‘正午’牡丹两种类型2n配子的产生途径为多倍体牡丹的培育提供了可能。相较于近缘杂种而言，较远缘物种间的杂种更有可能成为多倍体产生的来源[30]。因此，亚组间杂种牡丹有望成为牡丹多倍体育种的重要材料。

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