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滇牡丹花粉粒发育细胞学观察与雄蕊愈伤组织诱导及增殖培养

来源：花匠小妙招时间：2024-11-27 01:09

0. 引言

【研究意义】滇牡丹（Paeonia delavayi）属芍药科（Paeoniaceae）芍药属（Paeonia）牡丹组（Sect. Moutan）植物[1]，是中国西南地区特有植物，也是芍药属植物中地理分布最南的一个牡丹类群[2]。滇牡丹拥有丰富的花色，如红色、黑色、紫色、黄色等，是新品种选育和培育中不可替代的重要基因资源。然而牡丹组植物组织培养均存在生根困难、增殖率低、褐化严重等问题[3-7]，这已成为制约其优良品种繁殖、新品种培育和规模化推广种植的技术瓶颈[8-10]，为此其相关研究对产业发展具有重要意义。【前人研究进展】已有学者以鳞芽[11-12]、茎尖和茎段[13]、种胚[14-16]和胚珠[17]、叶片和叶柄[18-20]等外植体为材料进行牡丹愈伤组织诱导和再生体系建立的相关研究。而关于滇牡丹组织培养的研究报道较少，仅见到张艳丽等[21]和蒲艳等[22]采用滇牡丹的种胚和叶柄作为外植体成功诱导出愈伤组织的报道。【本研究切入点】花药是雄蕊的重要组成部分，花药诱导是获得单倍体植株的有效途径之一，滇牡丹每朵花中含有100余个雄蕊，能为愈伤组织诱导提供大量基因背景一致的外植体，可作为组织培养的重要外植体补充。刘会超等[23]和朱向涛等[24]已成功从牡丹花药中得到愈伤组织，但有关滇牡丹雄蕊与花药的研究则鲜见报道。【拟解决的关键问题】本研究以红色花滇牡丹8个生长阶段的花蕾为材料，确定各阶段花粉粒的主导发育时期，对外观形态与花粉粒发育时期之间的关系进行研究，建立二者间的相关性；探索适宜的消毒时间；筛选最佳诱导时期，最适诱导、增殖和不定芽分化培养基，以期完备滇牡丹雄蕊再生体系建立的前期工作，为建立完整的再生体系提供基础。

1. 材料与方法

1.1 试验材料

2022年3月中旬至5月中旬，采取滇牡丹红色花植株上不同大小的花蕾，根据花蕾大小和形态划分为硬蕾期（Y1−Y4）、透色期（T1−T4 ）等8个阶段（表1），每个阶段采集不少于5个花蕾。

表 1 滇牡丹花蕾外观形态与花粉粒发育时期的相关性

Table 1. Correlation between floral bud appearance and pollen grain development of P. delavayi

生长阶段
Growth
stage对应时期
Corresponding
period花蕾形态（直径大小）
Bud shape
（Diameter size，Φ）/mm单核中期花粉粒
Mid-mononuclear period pollen grains 单核靠边期花粉粒
Single-core sideline period pollen grains 双核期花粉粒
Binuclear period pollen grains 数量
Amount/个占比
Proportion/% 数量
Amount/个占比
Proportion/% 数量
Amount/个占比
Proportion/% Y1 硬蕾期萼片包裹紧实（Φ6～8） — — — — — — Y2 硬蕾期萼片包裹紧实（Φ10～12） 96 97.96 2 2.04 0 0.00 Y3 硬蕾期萼片包裹紧实（Φ13～14） 50 54.35 27 29.35 15 16.30 Y4 硬蕾期萼片包裹紧实（Φ15～17） 39 41.49 29 30.85 26 27.66 T1 透色期花瓣透色面积＜10%（Φ12～13） 18 19.78 46 50.55 27 29.67 T2 透色期花瓣透色面积10%～30%（Φ14～15） 11 11.34 52 53.61 34 35.05 T3 透色期花瓣透色面积30%～60%（Φ15～16.5） 5 5.49 32 35.16 54 59.34 T4 透色期花瓣开始松散，透色面积＞60%（Φ17～19） 4 4.71 23 27.06 58 68.24 1.2 试验方法 1.2.1 花粉粒细胞学观察

取Y2至T4共7个生长阶段的花蕾，FAA固定48 h后制作成石蜡切片，切片厚度为10 μm，使用Olympus BX53光学显微镜观察，并记录每切片40倍的5个视野下花粉粒各个发育时期数量，统计不同生长阶段花蕾中花粉粒各发育时期的比例，确定各阶段花粉粒的主导发育时期。

1.2.2 外植体消毒方法

花蕾经流水冲洗30 min后，转入超净工作台内使用1%次氯酸钠（NaClO）分别消毒3、5、8、10 min，再用无菌水冲洗3～5次，切开花蕾取出雄蕊接种在含有0.2 mg·L−1 萘乙酸（Naphthylacetic acid，NAA）的MS培养基中，每种处理接种30个外植体，3次重复。30 d后比较不同消毒时间雄蕊的污染率、褐化率及愈伤组织的诱导率，确定最佳消毒时间。

1.2.3 最佳诱导时期筛选

取Y3、Y4、T1和T2等4个生长阶段的花蕾，消毒后做切除花药端头1/4并保留完整的花丝的处理，接种至含有0.2 mg·L−1 NAA的MS培养基中，每瓶接种10个外植体，3瓶一组，重复3次。30 d后观察统计不同发育时期雄蕊的愈伤组织诱导结果，筛选最佳诱导时期。

1.2.4 愈伤组织诱导培养基优化

将无菌外植体接种至添加了不同质量浓度NAA、6-苄氨基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）的MS培养基中，以不添加生长调节剂的处理1作为对照（CK），各处理均接种30个外植体，重复3次，30 d后比较2种生长调节剂及其质量浓度对愈伤组织诱导的影响，确定最佳诱导培养基。

1.2.5 愈伤组织增殖培养基优化

将质地紧密、生长良好的愈伤组织转接至含有0.5 mg·L−1 NAA和0.25 mg·L−1 6-BA的Z1−Z3增殖培养基中，Z1−Z3培养基中分别添加0.5 mg·L−1 赤霉素（Gibberellin，GA3）、噻苯隆（Thidiazuron，TDZ）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D），每种培养基均接种20个外植体，重复3次。25 ℃暗培养25 d后统计生长量，后转入光照下培养观察愈伤组织的生长情况，比较不同植物生长调节物质对愈伤组织增殖的影响，筛选最佳增殖培养基。

1.2.6 愈伤组织分化培养基优化

从增殖培养后的愈伤组织中挑选质地紧密无褐化的材料转接到不定芽分化培养基中，以单因素分别研究GA3、毒莠定（Picloram，PIC）、水解酪蛋白（Casein Hydrolysate ，CH）和6-糠氨基嘌呤（6-Furfurylaminopurine，KT）对不定芽分化诱导的影响。每个单因素试验均接种20个外植体，重复3次。30 d后统计各处理中愈伤组织的不定芽分化率和死亡率等，筛选最佳分化培养基。

1.3 通用条件

试验中所使用的培养基均以MS作为基础培养基，30 g·L−1蔗糖作为糖源，6 g·L−1琼脂固化培养基，愈伤组织诱导使用0.5 g·L−1 聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinyl pyrrolidone，PVP），增殖培养与不定芽分化阶段使用1 g·L−1 PVP以减弱外植体的褐化。灭菌条件为121 ℃，20 min，高温高压灭菌前培养基的pH值均调至5.8~6.0；本试验在（25±2） ℃环境中进行培养，不定芽的分化诱导给予每天16 h的光照，其余皆为黑暗培养。

1.4 数据统计与分析

试验数据使用Office 2020记录，SPSS 26.0进行显著性分析，origin 2018绘图。相关计算公式如下：

（1）污染率/%=（污染的雄蕊数/接种的总雄蕊数）×100

（2）外植体的褐化率/%=（褐化的雄蕊数/接种的总雄蕊数）×100

（3）诱导率/%=（产生愈伤组织的雄蕊数/接种的总雄蕊数）×100

（4）生长量/g=增殖培养后的质量−增殖培养前的质量

（5）不定芽分化率/%=（分化出不定芽的愈伤组织数/接种的愈伤组织数）×100

（6）死亡率/%=（死亡的外植体数/接种的外植体数）×100

2. 结果与分析

2.1 滇牡丹花粉粒发育时期的细胞学观察

硬蕾期（Y）和透色期（T）的雄蕊观察到3个发育时期的花粉粒，分别为单核中期、单核靠边期和双核期。单核中期的花粉粒细胞核较大且位于细胞的中部（图1-A）；单核靠边期花粉粒的细胞核在液泡的挤压下逐渐往细胞壁的方向移动（图1-B）；双核期时可以清晰地看见2个细胞核（图1-C）。

图 1 滇牡丹花粉粒发育时期的细胞学观察（10×100）

A：单核中期； B：单核靠边期；C：双核期；红色箭头为细胞核位置。

Figure 1. Cytological observations on pollen grains of P. delavayi at development stages (10×100)

A: Mid-mononuclear period; B: single-core sideline period; C: binuclear period; red arrow indicates location of nucleus.

2.2 滇牡丹花蕾外观形态与花粉粒发育时期的相关性

滇牡丹花蕾呈椭圆形，雄蕊在发育早期为无色，随着花蕾的发育逐渐变为红色（图2）；花粉粒也依次进入不同的发育时期（表1），单核中期花粉粒数量随花蕾的发育依次减少，而双核期花粉粒数量逐渐增加。在花粉粒主导发育时期的变化过程中，花蕾的大小亦在变化，硬蕾期4个阶段间的花蕾大小区分明显，从6～17 mm梯度增长，此时单核中期的花粉粒由发育早期的97.96%下降至41.49%，双核期花粉粒从0%增加至27.66%；花蕾发育至透色期后，花瓣开始显露，随着花蕾的生长显露面积逐渐增加，花蕾中部突起明显，整体开始松散，双核期花粉粒也从透色初期的29.67%增加至花瓣开放前的68.24%，单核中期的花粉粒则减少至4.71%。

图 2 不同生长阶段滇牡丹花蕾

A：不同生长阶段雄蕊； B：不同生长阶段花蕾； Y1：硬蕾期1； Y2：硬蕾期2； Y3：硬蕾期3； Y4：硬蕾期4；T1：透色期1； T2：透色期2；T3：透色期3；T4：透色期4。

Figure 2. P. delavayi buds at different growth stages

A: Stamens at different growth stages; B: buds at different growth stages; Y1: hard bud stage 1; Y2: hard bud stage 2; Y3: hard bud stage 3; Y4: hard bud stage 4; T1: bud with visible color period 1; T2: bud with visible color period 2; T3: bud with visible color period 3; T4: bud with visible color period 4.

2.3 不同消毒时间对滇牡丹雄蕊消毒效果的影响

不同消毒时间对滇牡丹同一时期雄蕊的消毒效果不同（图3），根据方差分析结果所示，消毒时间对诱导率和污染率具有显著影响（P＜0.05），对褐化率无显著影响（P＞0.05）。外植体的褐化率高于95%且与消毒时间呈正相关关系，随消毒时间增加外植体褐化率上升；而诱导率则呈先升高后降低的趋势，在8 min时诱导率最高，达到94.62%，当消毒时间增加至10 min时，诱导率下降至88.89%；雄蕊的污染率随消毒时间的延长而降低，8 min时已无污染。综上，选择1%NaClO消毒8 min作为滇牡丹雄蕊的消毒处理。

图 3 滇牡丹雄蕊不同消毒时间的消毒效果

同组柱状图上的小写字母表示在 P＜0.05 水平差异显著。

Figure 3. Effect of treatment time on disinfection of P. delavayi stamens

Data with lowercase letters in same group indicate significant differences at P＜0.05.

2.4 最佳诱导时期的筛选

4个不同生长阶段的雄蕊外植体褐化率均大于95%，外植体的褐化率与褐化程度随培养时间的延长而增加，Y3和Y4阶段的褐化情况略好于T1和T2阶段；愈伤组织的诱导率为67.78%～91.11%（表2），愈伤组织主要集中在花药和花丝顶端处，且出现花药膨大，花丝伸长、弯曲和上翘现象。2个不同生长阶段的雄蕊愈伤组织诱导率差异显著（P＜0.05），透色期花蕾中的花粉粒主导发育时期为单核靠边期，此时接种的雄蕊诱导率最高，T1阶段诱导出的愈伤组织有轻微玻璃化；而T2阶段诱导的雄蕊愈伤组织外观呈白色、致密、团块状结构，生长状况良好。因此，单核靠边期的T2阶段花蕾是开展滇牡丹雄蕊愈伤组织诱导的最佳诱导时期。

表 2 不同生长阶段雄蕊的诱导结果

Table 2. Stamen induction at growth stages

生长阶段
Growth stage花粉粒主导发育时期
Period of dominant pollen grain development外植体褐化率
Browning rate of explants/%诱导率
Induction rate/%愈伤组织生长状态
Callus growth state褐化程度
Browning degree Y3单核中期97.80±1.91a67.78±1.73c少量白色致密的愈伤＋＋Y4单核中期98.90±1.91a78.89±1.73b中等白色致密的愈伤＋＋T1单核靠边期100.00±0.00a91.11±7.21a大量灰白色愈伤，轻微玻璃化＋＋＋T2单核靠边期100.00±0.00a82.22±5.03ab中等白色致密的团块状愈伤＋＋＋表中数据为均值±标准差。+表示较轻; ++表示一般; +++表示较重。同列数据后不同小写字母表示在0.05水平下差异显著，表3～5同。
Data are mean±standard error; +means lighter; ++means general; +++means heavier. Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences at P＜0.05. Same for Tables 3-5. 2.5 滇牡丹雄蕊愈伤组织诱导结果

经过1%NaClO消毒8 min后的T2阶段雄蕊在1～5号处理中的生长差异明显，在接种后的15 d左右可以看到愈伤组织的出现。添加生长素NAA和细胞分裂素6-BA都可有效提高雄蕊的愈伤组织诱导率（表3），均显著高于未添加任何植物生长调节剂的处理1（CK）（P＜0.05）；愈伤组织的诱导率随着2种植物生长调节剂的质量浓度增加而升高，表明雄蕊对生长素和细胞分裂素响应较好；但在相同质量浓度条件下，2种不同物质间的诱导效果均存在显著差异（P＜0.05），NAA对雄蕊愈伤组织诱导的促进作用强于6-BA，滇牡丹雄蕊在0.2 mg·L−1 NAA的处理3中诱导率最高。综上，选择MS+0.2 mg·L−1 NAA作为滇牡丹雄蕊愈伤组织诱导的培养基。

表 3 滇牡丹雄蕊诱导培养基的筛选

Table 3. Medium selection for P. delavayi stamen induction

处理
Treatment植物生长调剂
Plant growth regulator/
（mg·L−1）诱导率
Induction rate/%生长状态
Growth stateNAA6-BA 1（CK）——4.44±1.93d白色少量米点状愈伤20.05—36.67±3.33b黄白色少量点状愈伤30.2—80.00±5.77a黄白色中等团块状致密愈伤4—0.0527.78±5.09c白色少量点状愈伤5—0.241.11±1.93b白色中等团块状愈伤 2.6 滇牡丹雄蕊愈伤组织增殖培养结果

愈伤组织在进行不定芽的分化诱导前需对其进行增殖培养，以获得更为优良致密的愈伤。3种不同植物生长调节剂对滇牡丹雄蕊愈伤组织的增殖效果有显著差异（P＜0.05）（表4）。增殖效果最好的为添加0.5 mg·L−1 细胞分裂素TDZ的Z2培养基，经过25 d黑暗培养愈伤组织的平均生长量可达到0.27 g，其次是含有赤霉素GA3的Z1培养基，而添加生长素2,4-D的Z3培养基效果最差，平均生长量仅为0.06 g。此外，生长调节物质的种类还影响了愈伤组织对光照的敏感性（P＜0.05），当光照条件从24 h黑暗转变为每天16 h的光照后，白色的愈伤组织开始变绿，最早的转变出现在光照培养9 d后的Z1培养基中，在该培养基中的绿色愈伤转化率也最高，为后期分化培养提供了良好的愈伤组织。因此，最适合滇牡丹雄蕊愈伤组织增殖的培养基为：MS+0.5 mg·L−1 NAA+0.25 mg·L−1 6-BA+0.5 mg·L−1 GA3。

表 4 滇牡丹雄蕊愈伤组织增殖培养基的筛选

Table 4. Medium selection for P. delavayi stamen callus proliferation

培养基
Medium植物生长调节剂
Plant growth regulator/(mg·L−1)生长量
Growing quantity/g绿色愈伤占比率
Percentage of green callus/%绿色愈伤出现时间
Time of green callus愈伤组织状态
Callus state Z10.5 GA30.11±0.02b96.30±6.42a光培养后第9天黄绿色与淡绿色致密愈伤Z20.5 TDZ0.27±0.03a69.64±6.44b光培养后第14天浅黄绿色致密愈伤Z30.5 2,4-D0.06±0.02c27.04±1.60c光培养后第20天白色与浅黄绿色致密愈伤 2.7 滇牡丹雄蕊愈伤组织分化结果

将增殖培养后的愈伤组织转入分化培养基开展不定芽的诱导，先后进行了2次诱导均未成功分化出不定芽，结果如表5所示。从表5中可以看出，在首次诱导使用的M1–M3培养基中，GA3对愈伤组织的影响差异显著（P＜0.05），随着GA3质量浓度的增加，绿色愈伤组织的占比呈现先增后减的趋势，在中等质量浓度0.5 mg·L−1时达到了最高的占比96.67%，说明愈伤组织对GA3的响应较好；另外还在3个培养基中均发现了带有绿色点状凸起的愈伤组织（图4-A），有望后期分化出不定芽。第二次分化诱导以M2培养基为基础，分别增加了2种不同浓度的PIC、CH和KT，6个新的培养基对愈伤组织的影响差异显著（P＜0.05），原来翠绿色的愈伤组织在新的培养基中呈现出4种不同的生长状态，分别为生长良好的绿色愈伤组织（图4-B）、生长中等的黄绿色和黄褐色愈伤组织（图4-C、D）和出现褐化死亡生长差的黑褐色愈伤组织（图4-E）。上述3种生长调节剂对愈伤组织的优化效果依次为CH＞PIC＞KT（P＜0.05），低浓度的CH使半数以上愈伤组织的状态得到改善；PIC导致60%以上的愈伤组织出现黄化；在含有KT的M2-5与M2-6培养基中发现了愈伤组织的褐化死亡。综上，可采用MS+1 mg·L−1 6-BA+ 0.5 mg·L−1 GA3+ 200 mg·L−1 CH培养基开展滇牡丹雄蕊愈伤组织分化诱导的后续研究。

表 5 滇牡丹雄蕊愈伤组织分化培养基的筛选

Table 5. Medium selection for P. delavayi stamen callus differentiation

编号
No.植物生长调剂
Plant growth regulator/（mg·L−1）不定芽分化率
Bud differentiation
rate/%绿色愈伤占比率
Percentage of
green callus/%黄绿色愈伤占比率
Percentage of
yellow-green callus/%黄褐色愈伤占比率
Percentage of
yellow-brown callus/%黑褐色愈伤占比率
Percentage of
dark brown callus/% 6-BAGA3PICCHKT M1 1 0.2 — — — 0a 83.33±5.77b 0d 0d 0c M2 1 0.5 — — — 0a 96.67±2.89a 0d 0d 0c M3 1 1 — — — 0a 88.33±5.77b 0d 0d 0c M2-1 1 0.5 2 — — 0a 26.67±2.89e 35.00±0.00ab 38.33±2.89a 0c M2-2 1 0.5 4 — — 0a 38.33±2.89d 38.33±2.89a 23.33±2.89b 0c M2-3 1 0.5 — 200 — 0a 53.33±2.89c 35.00±5.00ab 11.67±2.89c 0c M2-4 1 0.5 — 400 — 0a 40.00±5.00d 36.67±2.89a 23.33±2.89b 0c M2-5 1 0.5 — — 0.5 0a 23.33±2.89e 25.00±0.00c 16.67±7.64bc 35.00±5.00a M2-6 1 0.5 — — 1 0a 36.67±2.89d 31.67±2.89b 23.33±2.89b 8.33±2.89b

图 4 5种不同状态的愈伤组织

A：带有点状突起的愈伤组织；B：绿色愈伤；C：黄绿色愈伤；D：黄褐色愈伤；E：黑褐色愈伤。

Figure 4. Calluses of 5 different types

A: Callus with punctate process; B: green callus; C: yellow-green callus; D: yellow-brown callus; E: dark-brown callus.

3. 讨论与结论

通过对滇牡丹不同生长阶段花蕾进行外观形态观察与大小测量，并对雄蕊中的花粉粒进行显微观察，发现花蕾的形态与其花粉粒的主导发育时期存在相关性。结果表明硬蕾期花粉粒的主导发育时期是单核中期，花蕾直径为10～17 mm；透色早期（T1、T2）为单核靠边期，其直径为12～15 mm，透色后期（T3、T4）为双核期，花蕾直径已接近20 mm。王雁等[25]在对滇牡丹中的黄牡丹（P.var. Lutea ）进行细胞学观察，发现在同一朵花的发育过程中，花粉粒的生长不仅与雌雄蕊发育存在着时序性相关，而且跟花蕾之间的形态特征也有着相对稳定的对应关系，当花蕾直径在0.5~1.0 cm时，花粉粒为单核期，当直径位于1.0~2.0 cm时，花粉粒为双核期，本研究结果与之在形态大小上略有不同，可能是由于花色不同导致。同时，魏乐等[26]通过对3种牡丹7个品种的花药壁消长、花粉粒发生、雄蕊发育时间等进行了观测，发现牡丹组不同种和不同栽培品种之间的发育节律均存在着稳定的规律性的差异，进一步证明这种现象在牡丹组植物中十分普遍。

分别选取了处于2个不同主导发育时期的雄蕊进行愈伤组织的诱导，结果表明以上2个时期均能诱导出愈伤组织。其中单核靠边期的诱导率为82.22%与91.11%，远大于单核中期的67.78%与78.89%，此外愈伤组织的状态明显优于单核中期，最终确定T2阶段的花蕾为滇牡丹雄蕊的最佳取材时期，这与朱向涛等[27]关于牡丹花药在单核中期诱导愈伤组织效果最佳的研究结果不同。虽然滇牡丹和牡丹同为牡丹组植物，亲缘关系较近，但在进化历史、基因型与生境等方面存在差异，推测可能是造成二者取材时期不同的原因之一。但是在雄蕊的愈伤组织诱导中，普遍以单核靠边期作为最佳取材时期[28-30]，也有些植物以单核中后期[31]的诱导效果更佳；另在番茄（Lycopersicon esculentum）的早期研究中发现其最佳取材时期并不唯一，最适的花粉粒发育时期为单核期或双核期[32]。

关于牡丹组织培养的报道较多，研究表明植物生长调节物质的种类与及其含量是影响愈伤组织诱导、增殖、分化与不定根形成的关键因素之一，常用的植物生长调节物质有NAA、2,4-D、6-BA、KT等。蒲艳等[22]在对滇牡丹叶柄愈伤组织诱导的研究中发现NAA 含量是影响其诱导和褐化的关键因子，本研究结果与之相符；6-BA是对牡丹叶芽生长影响最大的细胞分裂素[33]，在愈伤组织的增殖培养基中加入6-BA能够促进分化，GA3可打破牡丹组植物的上胚轴休眠，促进上胚轴伸长和根的萌动[4]，6-BA与GA3的配合使用比单独使用6-BA的效果更好[7、34]。本研究结果也与前人研究结果一致，在首次分化诱导中获得了大量带有点状凸起的愈伤组织；刘雪婷等[35]发现适宜的CH含量可显著提高芍药种胚丛生芽的增殖系数，也可使得丛生芽的生长更为健壮，本研究使用了中低质量浓度的CH都没有成功分化出不定芽，却使半数以上的愈伤组织在二次诱导保持较好的状态，猜测可能是因为在第二次诱导时才加入CH错过了愈伤组织分化的最佳时期而导致的，后继可进行更深入研究。此外，生长素/细胞分裂素的比例也对植物再生体系的完整建立起着重要的制约作用，适中比例可以促进愈伤组织的形成，低比例有利于芽的分化，高比例有利于根的分化[36-37]。增殖培养阶段能明显看出增殖效果与生长素/细胞分裂素比例间的关联，愈伤组织在比例较高的Z3培养基中增殖效果最差，也未见芽的分化，孟军等[38]的研究也表明了2,4-D不利于芽与根的分化，因此在以上环节要避免使用。

综上，滇牡丹雄蕊愈伤组织诱导、增殖和分化过程使用MS+0.2 mg·L−1 NAA可以获得80%的愈伤组织诱导率；愈伤组织的增殖培养基为MS+0.5 mg·L−1 NAA+0.25 mg·L−1 6-BA+0.5 mg·L−1 GA3；经过多项指标的比较得到初步的培养基MS+1 mg·L−1 6-BA+ 0.5 mg·L−1 GA3+ 200 mg·L−1 CH有望分化出不定芽。