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上转换纳米粒子结合DNA链式扩增技术在阿霉素光控释放中的应用

来源：花匠小妙招时间：2024-08-29 10:20

引用本文

于畅, 邵帅, 李贺杰, 刘国锋, 丁彬彬, 马平安, 林君. 上转换纳米粒子结合DNA链式扩增技术在阿霉素光控释放中的应用[J]. 应用化学, 35(12): 1485-1491
YU Chang, SHAO Shuai, LI Hejie, et al. Upconversion Nanoparticles Decorated with Hybridization Chain Reaction DNA for Near-infrared Light Controlled Release Doxorubicin[J]. Chinese Journal of Applied Chemistry, 35(12): 1485-1491

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本文属于开放获取期刊，遵循CCAL协议，使用请注明出处。

上转换纳米粒子结合DNA链式扩增技术在阿霉素光控释放中的应用

a中国科学院长春应用化学研究所,稀土资源利用国家重点实验室长春 130022

b中国科学院大学北京 100049

c长春理工大学化学与环境工程学院长春 130022

d吉林大学第二医院,耳鼻喉-头颈外科长春 130041

e吉林大学物理学院长春 130012

f中国科学技术大学合肥 230026

通讯联系人:林君,研究员; Tel:0431-85262031; Fax:0431-85698041; E-mail:jlin@ciac.ac.cn; 研究方向:发光材料。
共同通讯联系人:马平安,副研究员; Tel:0431-85262614; E-mail:mapa675@ciac.ac.cn; 研究方向:纳米材料的生物应用

收稿日期:2018-03-09修回日期:2018-03-14接受日期:2018-05-02

基金:

国家自然科学基金(51672268,51472233,51332008,51720105015,51628201,21521092),中国科学院前沿科学重点研究项目(YZDY-SSW-JSC018),吉林省科技引导计划(20170101188JC,20170414003GH)项目资助

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摘要

纳米技术的发展使得纳米材料可以通过不同的表面包覆和修饰而在生物医药中发挥应用。构建简单、经济、药物释放可控的生物相容性纳米药物仍是纳米生物化学领域的重点。我们构建的纳米载药体系(DDS)以NaYF4：Yb/Tm上转换纳米粒子为载体,在其表面通过光致断键型小分子4,5-二甲氧基-2-硝基苯基乙酮(DMNPE)连接一段短单链DNA,利用DNA链式扩增技术(HCR)来调节纳米粒子最终修饰的双链DNA的总量,从而控制对抗癌药物阿霉素(Dox)的担载量,在980 nm激光照射下上转换纳米粒子发射可切断DMNPE连接的近紫外光,协同胞内DNA酶的作用达到对药物的可控释放。由于近红外光照对生物组织具有较好的穿透能力,此体系能够对病灶位置有更好的光靶向性从而减少药物的毒副作用。

关键词:上转换纳米粒子;DNA链式扩增;控制释放;盐酸阿霉素

中图分类号:O611.4文献标志码:A文章编号:1000-0518(2018)12-1485-07

Upconversion Nanoparticles Decorated with Hybridization Chain Reaction DNA for Near-infrared Light Controlled Release Doxorubicin

YU Chang

a,b

,SHAO Shuai

a,c

,LI Hejie

,LIU Guofeng

a,e

,DING Binbin

a,f

,MA Ping'an

,LIN Jun

aState Key Laboratory of Rare Earth Resource Utilization,Changchun Institute of Applied Chemistry,Chinese Academy of Sciences,Changchun 130022,China

bUniversity of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China

cSchool of Chemistry and Environmental Engineering, Changchun University of Science and Technology,Changchun 130022,China

dDepartment of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Second Hospital of Jilin University,Changchun 130041,China

eCollege of Physics, Jilin University,Changchun 130012,China

fUniversity of Science and Technology of China,Hefei 230026,China

Corresponding author:LIN Jun, professor; Tel:0431-85262031; Fax:0431-85698041; E-mail:jlin@ciac.ac.cn; Research interests:luminescent materials.
Co-corresponding author:MA Ping'an, associate professor; Tel:0431-85262614; E-mail:mapa675@ciac.ac.cn; Research interests:application of nano-materials in biological field

Received:2018-03-09Revised:2018-03-14Accepted:2018-05-02

Fund:

Supported by the National Natural Science Foundation of China(No.NSFC51672268, No.51472233, No.51332008, No.51720105015, No.51628201, No.21521092), the Key Research Program of Frontier Sciences, CAS(No.YZDY-SSW-JSC018), Projects for Science and Technology Development Plan of Jilin Province(No.20170101188JC, No.20170414003GH)

; }

Abstract

Nanotechnology has allowed various coatings and modifications to nanostructures for applications of biomedicine. The constructions of simple, economical, controllable and biocompatible drug delivery systems(DDS) are still in demand. Here, we report a NaYF4：Yb/Tm nanoparticle-based DDS that anticancer drug doxorubicin(Dox) could be quantitatively carried by double stranded DNA thereon that self-assembled through a hybridization chain reaction(HCR). The HCR DNA was absorbed on the surface of upconversion nanoparticles(UCNPs) through linkage to photocleavable 1-(4,5-dimethoxy-2-nitrophenyl) diazoethane(DMNPE) molecules, which can be cleaved by near ultraviolet light emitted by UCNPs under 980 nm laser light excitation. The controllable release of model drug Dox by near-infrared(NIR) should facilitate selective cytotoxicity to target region and reduced side effects and could prove promising in biomedical applications.

Keyword:upconversion nanoparticles;DNA hybridization chain reaction;controllable release;doxorubicin hydrochloride

光控纳米材料如上转换纳米材料[1,2,3]、金纳米材料[4,5]、碳基纳米材料[6]等是纳米材料的研究热点,这是因为光刺激有其独特的时间和空间可控性质、不引起生物损伤及不改变pH值、离子浓度等其他生物参数从而在应用时具有生物安全性。这其中尤以近红外光(700~1000 nm)的应用更具前景,生物组织对近红外窗口的光吸收最少,从而近红外光能穿透的组织深度可达到几个厘米,利用近红外光可控释放药物也是纳米医药领域的热点。

抗癌药物阿霉素(Doxorubicin,Dox)属于蒽环类(anthracyclines)药物,同类药物还有柔红霉素(Daunorubicin)等,其结构扁平可以插入到DNA双螺旋的小沟中[7],这使利用DNA来装载Dox成为可能。 DNA链式扩增技术(HCR)反应[8]是通过设计合理的不同寡核苷酸,由一小段核苷酸链Trigger DNA(TrDNA)作为引发剂诱导短发夹结构单链寡核苷酸M1和M2相互杂交形成一条具有二维或三维空间结构的双链DNA,与传统DNA扩增方式聚合酶链式反应(PCR)不同的是HCR反应不需要温度循环和酶的参与。由于Dox插入核酸序列具有G-C偏好性[9],通过设计HCR反应中的M1和M2可以使其更有效率地装载及量化Dox。纳米粒子通过一段光致断键型小分子4,5-二甲氧基-2-硝基苯基乙酮(DMNPE)来修饰HCR的TrDNA组分(NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-TrDNA),体外引发HCR使纳米粒子表面修饰上双链DNA (NaYF4:Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR),通过980 nm激光照射上转换纳米粒子可以发射近紫外光释放DNA-Dox组分,以此达到可对纳米载药体系(DDS)的光控释药。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

Y2O3、Yb2O3、Tm2O3 购自长春海普瑞稀土材料技术有限公司;环己烷、氟化铵(NH4F)和无水乙醇购自国药集团化学试剂北京有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和正硅酸乙酯(TEOS)购自北京益利精细化学品有限公司;以上试剂均为分析纯。十八烯(>90.0%)和油酸(90%)购自德国Sigma-Aldrich公司;短单链DNA由上海生工公司合成;盐酸阿霉素(>98%)购自南京多点化学有限公司;DMNPE(98%)购自天津药明康德新药开发有限公司;硅藻土(Celite)购自美国Alfa Aesar公司。

FEI Tecnai G2 F20型透射电子显微镜(TEM,荷兰FEI公司);U-3100型紫外可见光光谱仪(UV-Vis,日本Hitachi 公司);F-7000型荧光光谱仪(日本Hitachi公司);Nikon Ti-S型倒置荧光显微镜(日本Nikon公司);FV 1000型共聚激光扫描显微镜(CLSM,日本Olympus公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 NaYF4：:Yb/Tm纳米粒子的合成与SiO2包覆

向三口瓶中加入预先配制的1 mol/L YCl3 695 μL、1 mol/L YbCl3 300 μL和0.1 mol/L TmCl3 50 μL;搅拌升温至80 ℃加入6 mL油酸和15 mL十八烯,升温至130 ℃维持60 min;降温到60 ℃以下加入NH4F 0.1482 g,NaOH 0.1 g的甲醇溶液;反应升温到70 ℃后立即升温到100 ℃,加冷凝管,连接抽真空装置开始抽真空;通入N2气,升温至300 ℃反应1.5 h;降温至60 ℃,结束反应,在离心管内用乙醇沉降产物,离心清洗,最后产物NaYF4：Yb/Tm纳米粒子分散在环己烷中。

介孔SiO2的包覆的过程如下:2 mL上转换纳米粒子的环己烷溶液(5~10 g/L)加入10 mL水和0.1 g CTAB,室温下快速搅拌至溶液澄清,加入3 mL乙醇和150 μL的 2 mol/L NaOH;体系搅拌升温到70 ℃,加入200 μL的TEOS反应10 min;离心产物,乙醇清洗3次后,转入含0.5 g NH4NO3的40 mL乙醇溶液中,60 ℃,反应6 h;产物经过离心清洗后重悬在水中。

1.2.2 DMNPE连接TrDNA

称量5 mg的DMNPE和50 mg二氧化锰加入1 mL的DMSO中,室温下搅拌40 min后将产物经填充100 mg硅藻土和玻璃丝的注射器过滤;100 μL的滤液中加入80 μL(20 nmol/L) 的TrDNA和100 μL DEPC处理水,室温搅拌1 h后再加入60 μL DMNPE滤液,搅拌过夜;通过5000相对分子质量的超滤离心管过滤产物,除去过量DMNPE。

1.2.3 HCR反应

将短发夹结构单链DNA M1和M2以及TrDNA用5×SSCT溶液稀释至3×反应浓度,M1和M2加热至95 ℃ 5 min,放置降至室温至少30 min;将M1、M2和TrDNA组分等体积加入EP(eppendorf)管中并立即混匀,室温反应1 h;凝胶电泳检测产物。

2 结果与讨论

2.1 纳米粒子的合成与表征

如图1所示,TEM照片显示合成的NaYF4：Yb/Tm上转换纳米粒子具有均一的形貌,介孔SiO2成功包覆在纳米粒子表面,高分辨图片可看到晶格条纹间距为0.31 nm,且荧光光谱980 nm激光照射下NaYF4：:Yb/Tm@SiO2在347、453和 476 nm处有发射峰。

Figure Option

图1 分散在环己烷中的NaYF4：Yb/Tm纳米粒子的透射电子显微镜照片(A),分散在水中的NaYF4：Yb/Tm@SiO2纳米粒子(B),纳米粒子的高分辨电子显微镜照片下的晶格条纹(C),纳米粒子在包覆介孔SiO2前后的发射光谱(980 nm激光激发,功率10 W/cm2)(D)Fig.1 TEM images of NaYF4：Yb/Tm nanoparticles(NPs) dispersed in cyclohexane(A) and NaYF4：Yb/Tm@SiO2 nanoparticles dispersed in water(B). HRTEM image and interplanar distance between adjacent lattice planes are shown in (C). Upconversional emission spectra of NaYF4：Yb/Tm NPs and NaYF4：Yb/Tm@SiO2 NPs under excitation of a 980 nm laser at a power density of 10 W/cm2(D)

DMNPE及其与核苷酸的连接分子式如图2A所示,硝基苄基邻位的酯基可以被近紫外光(>350 nm) 切断,从而释放与其连接的组分。 DMNPE的这种光可断键性质再结合其较好的生物相容性使其被应用于许多光控生物体系中[10,11,12]。如图2B所示,DMNPE与DNA组分的连接后在UV-Vis吸收检测时出现了在355 nm左右处的特征性平峰。修饰有DMNPE的TrDNA通过物理吸附连接在NaYF4：Yb/Tm@SiO2上即NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-TrDNA,通过P元素的分布(图2C)可以确定TrDNA成功装载于上转换纳米粒子上。

Figure Option

图2 DMNPE(a)及其与DNA单链结合(b)的分子式(A);DMNPE、DMNPE与DNA共价连接及连接产物接受紫外照射后的UV-Vis吸收谱图(B);TEM Mapping显示NaYF4：Yb/Tm@SiO2-TrDNA主要元素的分布(C)Fig.2 Chemical structure of DMNPE(a) and the photocleavable bond between DMNPE and phosphate backbone of DNA(b) are shown in (A); Absorption spectra of the native TrDNA(dot line), DMNPE-TrDNA(solid line), and DMNPE-TrDNA under 980 nm laser(dash line)(B). Element mapping of NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-TrDNA NPs(C)

2.2 HCR反应与Dox的装载

HCR反应的特点是常温反应且不需添加合成酶类,且3个组分中相对微量的TrDNA就能引发聚合反应,至体系中的M1和M2耗尽为止。根据Yan等[13]对提高HCR效率的碱基设计规律的总结,以及结合插入DNA序列的偏好使相同DNA投料下装载尽可能多的Dox,我们对TrDNA及M1、M2的设计见表1。

表1 HCR组分序列 Table 1 List of DNA sequence used in HCR

HCR合成产物的验证如图3A所示,在相同M1、M2投料量的前提下,TrDNA的量越少合成的DNA双链的平均长度越长,这点也能从图3A中的b、c、d (e、f、g为对照)3个泳道的结果得到验证。图3A中的h泳道所示TrDNA结合DMNPE后,仍可以引发HCR反应。需要注明的是HCR反应所得的DNA链长并不确定,所以电泳的结果看起来像是弥散的条带,实际是不同长度产物的混合物。

Figure Option

图3 (A)HCR反应产物的电泳图;a.DNA Marker, b.M1、M2和TrDNA的投料的摩尔比为1：1：1, c.投料比2：2：1, d.投料比1：1：0.1, e.M1和TrDNA 阴性对照, f.M2和TrDNA 阴性对照, g.M1和M2 阴性对照, h.TrDNA连接DMNPE后引发的HCR产物; (B)不同摩尔比的Dox和HCR产物孵合后产物的荧光光谱; (C)纳米粒子的Hela细胞内定位,NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR的HCR组分由FAM修饰的TrDNA引发DNA聚合,i.明场,.j.980 nm激发上转换成像, k.6-FAM荧光成像, l.j、j和k的照片复合Fig.3 (A)Electrophoresis image of HCR productions:a.DNA Marker; b.the molar ratio of M1, M2 and TrDNA is 1：1：1; c.the molar ratio is 2：2：1; d.the molar ratio is 1：1：0.01; e.negtive control of M1 and TrDNA; f.negtive control of M2 and TrDNA; g.negtive control of M1 and M2 DNA; h.the HCR production reacted from DMNPE-TrDNA. (B)Fluorescence spectra of different molar ratios of dox solution with HCR production. (C)Micrographs of Hela cellular uptake of NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR NPs triggered by 6-FAM modified TrDNA; i.bright-field image; j.upconversion luminescence image; k.fluorescence image of 6-FAM modified NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR NPs; l.overlay image of i, j and k

Dox在插入DNA后有荧光猝灭的特性,图3B为按照投料量计算的DNA双链与Dox在不同的摩尔比(以一对M1和M2互补为双链的长度为平均长度,即 n(G/C)： n(A/T)=31：17)混合时,Dox嵌入到双链中的情况,其积分面积与DNA的量有较好的线性关系,即可以利用HCR对纳米粒子的修饰来定量地装载Dox。

为了示踪细胞内修饰了HCR DNA的纳米粒子,我们用5'端修饰了6-FAM羧基荧光素的TrDNA引发HCR,将其与纳米粒子980 nm激发的上转换成像进行共定位(见图3),可以看到纳米粒子成功进入了细胞。

2.3 近红外光照调控的药物释放

进入到细胞中的载药纳米粒子,经过980 nm激光的激发能够切断DMNPE从而释放纳米粒子表面的DNA组分,细胞内存在降解异质DNA的脱氧核糖核酸酶,我们验证了脱氧核糖核酸酶的作用下DNA会释放与其结合的Dox(图4),图5的细胞内实验表明,经过980 nm激光激发Dox得到释放。

Figure Option

图4 Dox(a)与HCR DNA混合反应2 h后,经DNase I消化(20 U/mL, U:酶活力单位)前(b)后(c)Dox的荧光光谱Fig.4 Fluorescence spectra of Dox solution(a), Dox solution incubated with HCR DNA for 2 h(b) and the mixture of Dox and HCR DNA after 2 h digestion by DNase I(20 U/mL, U:enzyme unit)(c)Figure Option

图5 将载药纳米粒子NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR-Dox加入到Hela细胞中,通过980 nm激光的激发来促使药物在细胞内释放的激光共聚焦图。蓝色通道(左)为DAPI染细胞核,红色(中)为释放的Dox产生的荧光,最后一列(右)为两个通道的叠加Fig.5 The confocal laser scanning microscopy(CLSM) images of Hela cells with/without 980 nm laser irradiation after 10 min/30 min after incubation with NaYF4：Yb/Tm@SiO2-DMNPE-HCR-Dox. Each series can be sorted by the nuclei of cells being dyed in blue by DAPI(left), Dox released by NPs(middle) and a merge of the two channels of both above(right), respectively

3 结论

构建了一个基于上转换纳米粒子和DNA链式扩增技术(HCR)反应的纳米载药体系NaYF4：Yb,Tm@SiO2-DMNPE-HCR-Dox(DMNPE:1-(4,5-二甲氧基-2-硝基苯基)重氮乙烷,Dox:阿霉素), 将一小段引发DNA聚合的单链DNA通过光可断键小分子DMNPE连接在纳米粒子表面,通过不同的投料量可以调控后续生长在纳米载药体系表面的核酸量,借此可以调节可插入到DNA链的模式药物Dox的载药量;980 nm激光作用下使上转换纳米粒子发射近紫外光,以此断裂DMNPE,实现光控释药。

参考文献

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