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真菌18S rDNA/ITS菌种鉴定

来源：花匠小妙招时间：2024-11-26 10:02

1.菌种鉴定可以鉴定到种吗？

  16s rRNA作为菌种鉴定相似度超过97%一般定义为同一种菌。
  如果是sanger测序获得16s全长的都可以鉴定到种，甚至能区分亚种。有些细菌并不只有1个16s序列，会包含有1-15拷贝的16s序列，所以单一的16s序列鉴定可能会出现偏差。
  利用高通量如454或miseq测序一般由于读长的缘故，通常只有300-500多个碱基被测序，所以在物种鉴定上一般比较可靠的是能分类到属，部分能分类到种。
  根据我们的经验，不同的样品会有大约10-50的菌能分类到种。利用新的分析方法，我们现在也可以利用16s rRNA的群落多样性高通测序数据进行亚种级别的分析。主要是利用16s中共同变化的SNP位点进行分型。这样可以大大提高菌种的分类精度，尤其是在有些菌株之间表型差异巨大的时候。

2.菌种鉴定的方法简介

在做菌种鉴定之前，首先要确定待鉴定的菌种是不是纯种，这也是至关重要的一步。菌种不纯是不会得到正确的结果的。纯化方法，常用的有两种

方法原理优点缺点例如平板划线分离法把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基，通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种可以观察菌落特征，对混合菌进行分离不能计数，一般用于从菌种的分离纯化。筛选大肠杆菌菌种。稀释涂布平板法将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的表面，进行培养。在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的微生物将被分散成单个细胞，从而能在培养基表面形成单个的菌落。可以计数，可以观察菌落特征。吸收量较少，较麻烦，平板不干燥效果不好，容易蔓延。一般用于平板培养基的回收率计数。测定纯净水中大肠杆菌的含量。

菌种鉴定的方法一般有常规鉴定和分子生物学方法：

（1）常规鉴定：菌落形态观察、革兰氏染色、菌毛染色、糖类分解实验、吲哚实验、淀粉水解实验、V-P实验、甲基红实验、柠檬酸盐利用实验、硝酸盐还原实验、接触酶实验等

（2）分子生物学方法：细菌16SrDNA菌种鉴定：提取DNA，特定引物PCR扩增，PCR产物纯化测序，进化树分析；真菌18S rDNA/ITS菌种鉴定流程也是一样的。

3.文献中未知菌鉴定中有菌落特征的观察，为什么不指明用何种培养基、培养基状态（固、液）及培养条件（时长、温度）？

不同类型的菌在不同培养基上有显著牲，尤其在显色培养基上，更能一目了然，有辅助判定的作用；但未知菌无法确定在哪种培养基上生长好，以及生长条件等，所以食品安全控制中着重检致病菌，比如检验是否有空肠弯曲菌，有一整套方法，42度，微厌氧条件比较合适，还要增菌；但未知菌不可能把这些条件都尝试一下，我们的方法是全用营养琼脂培养，如果需氧条件下不长，就再实验一下厌氧条件，35度左右培养，时间以长出合适实验的菌为宜.

4.菌种长时间保存后复苏，如何鉴定有没有改变？

(1).仔细观察单菌落的形态结构，比较该单菌落与目的菌单菌落的外在特征，或者查找目的菌特有的生理生化特性，比较现有菌，一般可以作出判断。

(2).如果不能轻易判断，建议对菌株的16sRNA的基因序列进行测序，测序结果与数据库中数据进行比对，建立个系统进化发育树，这样可以精确的判断菌株是否发生改变。

5.微生物的菌种鉴定可以鉴定到"株"一级吗？

如果菌株是自然界中分离得到，就只能鉴定到种，不能鉴定到株，因为多多少少和其他株系的细菌有区别，即便你做了一些特征的鉴定，发现和某一株细菌一模一样，你也没有理由说你的细菌就是那一株细菌，因为你不可能把所有的特征都做完，株和株之间的关系就相当于不同的人之间的关系，世界上不可能有完全相同的两个人。除非你知道你的细菌本来就是某一株细菌扩增出来的（而且要保证没有变异，否则就是一个新株），可是这样就没必要鉴定了。

6.PCR扩增切胶纯化测序出现套峰是什么情况？

(1)测序结果个别碱基出现N，或者部分连续出现套峰，是由菌种rDNA多态性造成，对菌种鉴定无影响；

(2)所有测序反应均出现大面积套峰，由于客户提供样品模板不纯造成，这种情况需要客户重新纯化菌种或进行TA克隆。

7.常规鉴定中，如何判断菌种质量？

(1).肉眼观察：优良菌种菌丝浓白，绒状，粗壮密集，生长整齐，速度快，香味浓厚。

(2).优良菌种标准可归纳为："纯、香、正、壮、润"五个字。检查时，打开瓶塞，从菌种瓶中部取出小块菌丝体，观察色泽，闻其气味，手捏料块检查其含水量，看是否符合上述要求标准。

(3).显微镜检查：挑取少量菌丝，置显微镜上观察其形态，菌丝分枝，分隔情况，锁状联合，细胞膜的厚薄。培养观察：从菌种瓶中挑取小块菌丝体，接种斜面试管培养基上，置23℃～25℃恒温中培养，经五周后检查菌种生活力。如果菌丝生长快，旺盛纯一，健壮浓厚，长且整齐，则表示菌种的生活力强。

(4).分块法：在桌上放一张白纸，把菌龄相同的菌种从瓶内取出一大块，用手分成2块，再把2块分成4块，4块分成8块，依次进行。优良菌种整块多，碎渣少。劣次菌整块少，碎渣多。

(5).液体菌种鉴别：当三角瓶或发酵缸培养3-7天后，如液面出现气泡，产生"油皮"、混浊等现象，说明菌种本身带有杂菌。如菌块上浮，或迟迟长出很薄的菌丝层，则说明菌种生活力弱。白块四周的菌丝生长快、浓白、棉絮状，表明菌种生命力强。