一种高含β

本发明涉及发酵法制备功能性食品
技术领域：
，尤其涉及一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法。
背景技术：
：烟酰胺单核苷酸(nmn)是人体内一种内源性物质，由烟酰胺在烟酰胺磷酸核糖转移酶的催化下生成，随后nmn又在烟酰胺单核苷酸腺苷转移酶的催化下生成nad+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)。nmn在人体内的生理作用都是通过转化为nad+完成。已有的科学研究表明，nmn可以改善缺血性脑损伤和阿尔茨海默症，对帕金森病、退行性疾病]和肥胖具有治疗作用，还可减轻心肌缺血再灌注损伤及脑出血脑梗出血损伤等；近期研究最热的是nmn在延缓衰老、医药保健品方面的开发应用。美国科学家davidsinclair博士已经在小鼠身上证实了nmn具有逆转生理老化的作用，2016年日本率先推出了主打产品，但β-烟酰胺单核苷酸含量只有3000mg(只够吃10天)，但售价却近7000元。日本β-烟酰胺单核苷酸产品糟糕的性价比限制了这一革命性抗衰老物质的推广，让其几乎沦为了富人的特权。2018年，美国生物技术公司herbalmax发布了一种基于哈佛医学院研究成果的膳食补充剂产品reinvigorator(中译：瑞维拓)，其主要成分为nmn，herbalmax通过生物酶催化技术成功将食药级nmn的价格下降了90％以上(京东、天猫、苏宁等基础版定价不超过2000元)，才使得nmn的服用成本进入了一般高收入群体的承受范围。2018年，nmn经哈佛大学格伦衰老生物学中心实验证实，能够将哺乳动物寿命延长30％以上。为此，nmn抗衰老效用的主要发现者——哈佛医学院教授、保罗·f·格伦生物衰老生物学中心主任davidsinclair也被时代杂志评为“全球最有影响力的100人”。2020年2月11日，哈佛大学医学院的davidsinclair教授和新南威尔士大学的lindsaywu教授带领团队研究出一项新成果：nmn可以逆转卵母细胞衰老，从而挽回生殖衰老期间女性的生育能力。除了含nmn活性成分的药品和保健品外，天然食物如蔬菜、水果、肉类和哺乳动物的乳液中也发现nmn。根据fda的等效原则，一个70kg的成年人每天应补充600mg的nmn，一个成年人补充同等量的nmn，则需要吃掉54～240kg的西蓝花，由此可见，通过直接食用西蓝花来源补充的效率较低，而通过发酵法制备一种高含nmn的西蓝花提取物(含nmn5.0％以上w/w)可以较快达到这一效果。已有专利cn110559224a一种西兰花提取物及制备方法和用途。该方法是取西兰花粉，加入提取溶剂，超声辅助提取60～90min，收集提取液，冷却，离心，经减压过滤和滤膜超滤，收集滤液；c)将收集的滤液进行真空冷冻干燥，得西兰花提取物。采用该方法制备得到的西兰花提取物中烟酰胺单核苷酸的含量仅为13.724μg/mg(约相当于1.4％w/w)。目前国内其他报道的生产工艺还有采用化学合成法和酶法工艺，其中化学合成法是以烟酸核糖为原料，用三氯氧磷进行磷酸化得到nmn(参考文献：chem.commun.1999,729-730)，得率低，产品纯度差，而且用到大量的有机溶剂，对环境破坏严重，其中三氯氧磷是比较危险的试剂。全酶法工艺(cn201611245619)，以烟酰胺核糖为底物，在atp等磷酸供体存在下，在烟酰胺核糖激酶或含有烟酰胺核糖激酶的重组细胞的催化下反应生成β-烟酰胺单核苷酸。所用的烟酰胺核糖激酶来自酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)。但是现有的上述两种方法实际生产过程中都用到大量的有机溶剂、酸碱，对环境造成较大的污染。技术实现要素：1.要解决的技术问题本发明的目的是为了解决现有技术中实际生产过程中都用到大量的有机溶剂、酸碱，对环境造成较大的污染的问题，而提出的一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法。2.技术方案为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤一：前处理，将西蓝花分别拣选、清洗、臭氧杀菌、淋洗沥干、打浆，经浓浆泵打入无菌发酵罐中，再加入红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)、人参提取浓缩液(含atp)、水搅拌混合均匀。步骤二：发酵前酶解，将步骤一前处理得到的混合浆添加果胶酶、纤维素酶进行酶解，酶解温度40-55℃，酶解ph3.4-6.5，酶解时间2h-8h。步骤三：发酵，将步骤二酶解得到的混合液分别添加葡萄糖、烟酰胺、硫酸镁、磷酸氢二钾，搅拌溶解，加热，进行灭酶灭菌，混合液降温至20-32℃，接种发酵剂酿酒酵母，接种量0.05-0.1％，温度维持20-32℃，进行发酵3-7天，发酵过程进行间歇性搅拌，每隔12小时搅拌20-30分钟，搅拌方式可以是机械搅拌，也可以通入无菌压缩空气搅拌。步骤四：后处理，将步骤三发酵得到的发酵液，进行灭菌、冷却、离心分离收集滤液、减压低温浓缩至浸膏相对密度1.01-1.05、真空冷冻干燥，得到一种高含nmn西蓝花提取物，nmn含量可达5.0％(w/w)以上，可用于抗衰老功能性食品；其中灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟；其中减压低温浓缩温度30-50℃，优选35-45℃，真空度80pa以下。优选地，所述步骤一中西蓝花300-600份、红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)100-300份、人参提取浓缩液(含atp)100-300份和水200-500份。优选地，所述步骤二中酶解温度最优选48-52℃。优选地，所述步骤二中酶解最优选ph4.0-5.0。优选地，所述步骤二中酶解时间优选4-5h。优选地，所述步骤二中果胶酶添加量是0.01-0.07％；其中纤维素酶(1万u/g)添加量0.05-0.15％。优选地，所述步骤二中果胶酶添加量优选0.03％-0.05％。优选地，所述步骤二中纤维素酶(1万u/g)添加量优选0.1-0.12％。优选地，所述的步骤三发酵菌种是从新鲜西蓝花中分离筛选得到的，作为原始菌株，经过活化(斜面培养)、扩培(液体培养)、卡氏罐放大培养，发酵结束后发酵液经过离心分离得到酿酒酵母菌泥，接种到西蓝花酶解混合液进行发酵；或者不经过离心分离，将卡氏罐中的酵母菌液直接投入到蓝花酶解混合液进行发酵。优选地，所述步骤三中葡萄糖1-8％、烟酰胺0.1-1.0％、硫酸镁0.01-0.03％、磷酸氢二钾0.2-0.3％，其中灭酶灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭酶灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟。3.有益效果相比于现有技术，本发明的优点在于：本发明中，以较低的成本产出高含nmn产品(含nmn5.0％以上w/w)，比现有技术(cn110559224a，西蓝花提取物约含nmn1.4％w/w)并且对环境污染相对传统方法大为减少。附图说明图1为本发明提出的一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法实施例3中的样品图谱；图2为本发明提出的一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法实施例3中的对照品图谱。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤一：前处理，将西蓝花分别拣选、清洗、臭氧杀菌、淋洗沥干、打浆，经浓浆泵打入无菌发酵罐中，再加入红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)、人参提取浓缩液(含atp)、水搅拌混合均匀。步骤二：发酵前酶解，将步骤一前处理得到的混合浆添加果胶酶、纤维素酶进行酶解，酶解温度40-55℃，酶解ph3.4-6.5，酶解时间2h-8h。步骤三：发酵，将步骤二酶解得到的混合液分别添加葡萄糖、烟酰胺、硫酸镁、磷酸氢二钾，搅拌溶解，加热，进行灭酶灭菌，混合液降温至20-32℃，接种发酵剂酿酒酵母，接种量0.05-0.1％，温度维持20-32℃，进行发酵3-7天，发酵过程进行间歇性搅拌，每隔12小时搅拌20-30分钟，搅拌方式可以是机械搅拌，也可以通入无菌压缩空气搅拌。步骤四：后处理，将步骤三发酵得到的发酵液，进行灭菌、冷却、离心分离收集滤液、减压低温浓缩至浸膏相对密度1.01-1.05、真空冷冻干燥，得到一种高含nmn西蓝花提取物，nmn含量可达5.0％(w/w)以上，可用于抗衰老功能性食品；其中灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟；其中减压低温浓缩温度30-50℃，优选35-45℃，真空度80pa以下。实施例2：一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤一：前处理，将西蓝花分别拣选、清洗、臭氧杀菌、淋洗沥干、打浆，经浓浆泵打入无菌发酵罐中，再加入红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)、人参提取浓缩液(含atp)、水搅拌混合均匀，所述步骤一中西蓝花300-600份、红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)100-300份、人参提取浓缩液(含atp)100-300份和水200-500份。步骤二：发酵前酶解，将步骤一前处理得到的混合浆添加果胶酶、纤维素酶进行酶解，酶解温度40-55℃，酶解ph3.4-6.5，酶解时间2h-8h，所述步骤二中酶解温度最优选48-52℃，所述步骤二中酶解最优选ph4.0-5.0，所述步骤二中酶解时间优选4-5h，所述步骤二中果胶酶添加量是0.01-0.07％；其中纤维素酶(1万u/g)添加量0.05-0.15％，所述步骤二中果胶酶添加量优选0.03％-0.05％，所述步骤二中纤维素酶(1万u/g)添加量优选0.1-0.12％。步骤三：发酵，将步骤二酶解得到的混合液分别添加葡萄糖、烟酰胺、硫酸镁、磷酸氢二钾，搅拌溶解，加热，进行灭酶灭菌，混合液降温至20-32℃，接种发酵剂酿酒酵母，接种量0.05-0.1％，温度维持20-32℃，进行发酵3-7天，发酵过程进行间歇性搅拌，每隔12小时搅拌20-30分钟，搅拌方式可以是机械搅拌，也可以通入无菌压缩空气搅拌，所述的步骤三发酵菌种是从新鲜西蓝花中分离筛选得到的，作为原始菌株，经过活化(斜面培养)、扩培(液体培养)、卡氏罐放大培养，发酵结束后发酵液经过离心分离得到酿酒酵母菌泥，接种到西蓝花酶解混合液进行发酵；或者不经过离心分离，将卡氏罐中的酵母菌液直接投入到蓝花酶解混合液进行发酵，所述步骤三中葡萄糖1-8％、烟酰胺0.1-1.0％、硫酸镁0.01-0.03％、磷酸氢二钾0.2-0.3％，其中灭酶灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭酶灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟。步骤四：后处理，将步骤三发酵得到的发酵液，进行灭菌、冷却、离心分离收集滤液、减压低温浓缩至浸膏相对密度1.01-1.05、真空冷冻干燥，得到一种高含nmn西蓝花提取物，nmn含量可达5.0％(w/w)以上，可用于抗衰老功能性食品；其中灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟；其中减压低温浓缩温度30-50℃，优选35-45℃，真空度80pa以下。实施例3：参照图1-2，一种高含β-烟酰胺单核苷酸(nmn)西蓝花提取物的制备方法，包括以下步骤：步骤一：前处理，将西蓝花分别拣选、清洗、臭氧杀菌、淋洗沥干、打浆，经浓浆泵打入无菌发酵罐中，再加入红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)、人参提取浓缩液(含atp)、水搅拌混合均匀，所述步骤一中西蓝花300-600份、红枣提取浓缩液(含环磷腺苷)100-300份、人参提取浓缩液(含atp)100-300份和水200-500份。步骤二：发酵前酶解，将步骤一前处理得到的混合浆添加果胶酶、纤维素酶进行酶解，酶解温度40-55℃，酶解ph3.4-6.5，酶解时间2h-8h，所述步骤二中酶解温度最优选48-52℃，所述步骤二中酶解最优选ph4.0-5.0，所述步骤二中酶解时间优选4-5h，所述步骤二中果胶酶添加量是0.01-0.07％；其中纤维素酶(1万u/g)添加量0.05-0.15％，所述步骤二中果胶酶添加量优选0.03％-0.05％，所述步骤二中纤维素酶(1万u/g)添加量优选0.1-0.12％。步骤三：发酵，将步骤二酶解得到的混合液分别添加葡萄糖、烟酰胺、硫酸镁、磷酸氢二钾，搅拌溶解，加热，进行灭酶灭菌，混合液降温至20-32℃，接种发酵剂酿酒酵母，接种量0.05-0.1％，温度维持20-32℃，进行发酵3-7天，发酵过程进行间歇性搅拌，每隔12小时搅拌20-30分钟，搅拌方式可以是机械搅拌，也可以通入无菌压缩空气搅拌，所述的步骤三发酵菌种是从新鲜西蓝花中分离筛选得到的，作为原始菌株，经过活化(斜面培养)、扩培(液体培养)、卡氏罐放大培养，发酵结束后发酵液经过离心分离得到酿酒酵母菌泥，接种到西蓝花酶解混合液进行发酵；或者不经过离心分离，将卡氏罐中的酵母菌液直接投入到蓝花酶解混合液进行发酵，所述步骤三中葡萄糖1-8％、烟酰胺0.1-1.0％、硫酸镁0.01-0.03％、磷酸氢二钾0.2-0.3％，其中灭酶灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭酶灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟。步骤四：后处理，将步骤三发酵得到的发酵液，进行灭菌、冷却、离心分离收集滤液、减压低温浓缩至浸膏相对密度1.01-1.05、真空冷冻干燥，得到一种高含nmn西蓝花提取物，nmn含量可达5.0％(w/w)以上，可用于抗衰老功能性食品；其中灭菌温度控制在60-90℃，优选75-85℃，灭菌时间10-40分钟，优选20-30分钟；其中减压低温浓缩温度30-50℃，优选35-45℃，真空度80pa以下。本发明中，发酵菌种酿酒酵母是从新鲜西蓝花中分离筛选得到的，作为原始菌株，制备成甘油冷冻管(-80℃保藏)。再经过斜面培养活化(培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母浸粉1％、琼脂粉1.5％；28±2℃，42h)、液体培养扩培(培养基：葡萄糖2％、蛋白胨1％、酵母浸粉1％、琼脂粉1.5％；250ml摇床震荡，28±2℃，24h)，培养结束再接入10升装有5kg麦芽汁(12度)的卡氏罐放大培养(25℃，72h)，发酵结束后，发酵液经过冷冻离心机离心(4000转/分，10分钟)分离得到酿酒酵母菌泥120g(含水量：80％)。本发明中，西蓝花提取物nmn的含量测定方法，样品前处理：取制备得到的西蓝花提取物约0.1g，精密称定，加至100ml容量瓶，加水50ml溶解，超声10min，然后加水稀释至100ml，混匀。取部分溶液放入离心管中，4500r/min，离心20min，取上清液，经0.45μm滤膜过滤，备用。另取nmn对照品适量，精密称定，制备成含nmn约0.1mg/ml的对照品溶液，备用。本发明中，高效液相色谱法色谱条件：色谱柱岛津shim-packvp-ods(150mm×4.6mm，5μm)，柱温：40℃；流动相：a为0.1％的乙酸水溶液，b为含2mmol/l醋酸铵的甲醇溶液；流速为1.0ml/min，检测波长：244nm，进样量为10μl。本发明中，梯度洗脱条件：时间(分钟)流动相a流动相b095536535501008.195512955。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。当前第1页12

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