黄瓜花叶病毒dsRNA的研究

【摘要】： Double stranded RNA(dsRNA)是植物RNA病毒复制过程的中间产物，这些dsRNA的大小对应于RNA病毒的基因组，而正常的植物组织不含有或仅产生小分子量的dsRNA，因此可通过提取dsRNA对该类病毒进行检测、鉴定等方面的研究。黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)是一个典型的三分体正链RNA病毒，由于寄主范围广，危害大，并且易于接种，而一直被作为病毒模式种来研究。本文用CMV做为研究对象来探索dsRNA提取的条件；利用dsRNA技术分析该三分体病毒的各基因组在复制过程中的时序变化；同时用CMV卫星RNA的高拷贝特性，以获得高得足够的dsRNA，用来制备dsRNA抗体。研究分为三个部分。 本文依据CMV在烟草等系统寄主上的快速复制和高拷贝特性探讨了不同条件对dsRNA提取效果的影响，总结了提取dsRNA的优化条件。结果显示：1)在17％乙醇浓度提取dsRNA的效果最好；2)植物的生长状态影响dsRNA的提取效果，幼嫩的植物组织提取dsRNA的效果好，杂质少；3)比较接种后不同时间后提取dsRNA的效果，以14天左右后提取的效果较好，此时提取5g的感病叶片可得到约2.5μg的卫星-dsRNA；4)在1.5ml eppendorf管中多次离心代替纤维素柱层析的小量快速提取dsRNA的方法也能收到较好的效果。 CMV的卫星RNA是一种依赖其辅助病毒CMV进行复制和扩散的亚病毒因子。本实验通过提取不同寄主(心叶烟、假酸浆、西葫芦)上，不同时间(接种后2d、4d、8d、16d、32d、48d、64d)CMV的dsRNA，分析2个CMV毒株(不携带卫星RNA的CFq毒株和携带卫星RNA的CYi毒株)的基因组各组分dsRNA含量随时间的变化以及卫星RNA对辅助病毒CMV复制的影响。结果表明：CMV基因组三组分的dsRNA含量在第2～8天时比较接近，之后则RNA3-dsRNA的含量一直较高，并在第16天时含量达到最高，而RNA2-dsRNA与RNA1-dsRNA的含量则下降，且两者比较接近；携带卫星RNA的CYi毒株其卫星-dsRNA的相对含量始终高于各基因组dsRNA的含量，卫星-dsRNA与RNA3-dsRNA的含量比值在不同寄主植物中则是西 摘要 葫芦>假酸浆>心叶烟，西葫芦上的比值显著高于其它两种寄主(第4~16天);RNA3 与RNAI的dsRNA含量比值在两个毒株间则是:C肠>CFq。以上现象说明卫星RNA 与CMV基因组RNA存在寄主选择性，同时CMV基因组各组分也存在时序表达的 差异。 CMV的卫星RNA有高拷贝、快速复制的特性，相应产生大量的dsRNA，将纯 化的卫星一dsRNA与牛血清白蛋白交联制备成抗原，利用脂质体包裹，随后免疫动物， 以获取针对dsRNA的抗体，用来检测植物是否感染RNA病毒。凝胶电泳结果说明 甲醛可使dsRNA与牛血清蛋白交联。用免疫电泳初步检测，发现该抗血清除可与 dsRNA形成沉淀线外，还与质粒DNA及线状dsDNA发生交叉反应，说明dSRNA抗 体特异性不够强。

【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2004

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