无标记DNA杂交与单分子荧光成像检测的竞争性检测,Analytical Chemistry

荧光标记生物分子的单分子成像是一种用于测量缔合相互作用的强大技术。但是，必须注意确保荧光标记不会影响所探测的系统。需要无标记技术来了解不受附着标记影响的生物分子相互作用，但是这些技术通常缺乏敏感性和特异性。为了解决这些挑战，我们开发了一种竞争性检测方法，该方法使用单分子检测来跟踪未标记的目标单链DNA（ssDNA）的种群，该单链DNA与固定在玻璃界面上的探针DNA杂交，方法是使用荧光标记的“示踪剂”检测单个双链体” ssDNA。通过标记一小部分（<0.2％）的目标分子，“示踪剂” DNA可以跟踪可用的探针DNA位点，而不会与未标记的目标群体发生显着竞争。单分子荧光成像是一种用于竞争性测定的良好读出方案，因为它足够灵敏，可检测到探针DNA的密度相对较低（约10）的底物上的示踪剂DNA。–3的单分子层，因此空间相互作用不会阻碍DNA杂交。竞争测定法用于测量9个碱基对和10个碱基对靶标的互补链DNA杂交的缔合常数，其中示踪剂测定法预测与传统置换竞争测定法相同的缔合常数。该方法用于比较相同DNA链的杂交K a，区别仅在于在溶液相靶标的5'末端存在荧光标记。荧光标记的添加通过3.6 kJmol –1显着稳定了DNA双链体，比其他腺嘌呤-胸腺嘧啶碱基配对相互作用2.7 kJmol –1增强了稳定性。。这种竞争性示踪剂测定可用于筛选许多标记和未标记的靶DNA链，以测量荧光标记对双链体稳定性的影响。这种单分子竞争性杂交方案可以轻松地应用于灵敏的测定中，其中示踪剂和靶寡核苷酸之间对探针位点的竞争可用于测量未标记的DNA或RNA的浓度。

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