一种牡丹外植体直接植株再生的方法技术

本发明专利技术涉及植物组培技术领域，尤其涉及一种牡丹外植体直接植株再生的方法。该方法以牡丹的子叶为外植体，接种于诱导培养基中诱导10‑15天，然后置于直接分化培养基中继代培养；诱导培养基包括：MS组培基本培养基、0.4‑0.8mg/L TDZ以及0.8‑1.5mg/L NAA；直接分化培养基包括：WPM组培基本培养基、0.4‑1.2mg/L CPPU以及0.2‑0.5mg/L TDZ。本发明专利技术首次通过外植体直接再生途径(无需诱导出愈伤组织)成功实现离体培养条件下植株再生，并驯化成活，同时，能极大程度地缩短牡丹分生结节植株再生体系的周期，为牡丹离体快繁、遗传转化提供新技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及植物组培，尤其涉及一种牡丹外植体直接植株再生的方法。

技术介绍

1、牡丹(paeonia sect.moutan)为芍药科(paeoniaceae)芍药属(paeonia)落叶亚灌木，是中国传统名花，兼具文化、观赏及药用价值。近年来，牡丹籽的油用价值逐渐被发掘，具有巨大的市场需求。然而，播种、嫁接、分株等传统繁殖方式效率低、周期长，采用传统繁殖方法进行牡丹新品种培育需要超过10年的时间，极大地限制了其育种进程与产业发展。

2、植物组织培养离体再生具有繁殖效率高、周期短、保持遗传稳定性等优势，是牡丹商业化生产及通过生物技术进行定向遗传改良的必要手段。自1965年开始进行牡丹组织培养技术研究，迄今约60年的持续摸索发现牡丹离体再生技术难度极大，其中愈伤组织分化难是卡脖子的关键问题，通过愈伤组织器官再生和体细胞胚再生途径均未能建立稳定的再生体系，且外植体直接再生体系缺乏，若能跳过愈伤组织步骤，实现外植体直接再生，将是牡丹离体再生技术的一大突破。

3、分生结节(meristematic nodule,mn)是一种与体细胞胚外观相似，但具有明显组织学差异、能长期稳定增殖且具有高度分化能力的特殊结构，因其独特的结构特征与优势，分生结节被定义为除器官发生、体细胞胚发生外的第三种体外再生途径，是建立体外再生体系、代谢物质生产及植物遗传转化研究的理想替代途径。

4、前期研究cn 113115708 a中专利技术人首创性地通过分生结节途径实现了牡丹愈伤组织分化与植株再生，但是也需要先通过外植体诱导愈

5、因此，建立外植体直接再生体系、缩短再生体系的周期成为牡丹研究者目前需要攻克的问题。

技术实现思路

1、本专利技术为了解决目前牡丹外植体直接再生体系缺乏、离体再生技术体系耗时较长的问题，特提出如下专利技术。

2、首先，本专利技术提供了一种牡丹外植体直接植株再生的方法，包括：

3、以牡丹的子叶为外植体，接种于诱导培养基中诱导10-15天，然后置于直接分化培养基中继代培养；

4、所述诱导培养基包括：ms组培基本培养基、0.4-0.8mg/l tdz以及0.8-1.5mg/lnaa；

5、所述直接分化培养基包括：wpm组培基本培养基、0.4-1.2mg/l cppu以及0.2-0.5mg/l tdz。

6、通过上述方法，本专利技术首先诱导进行脱分化(但未形成愈伤组织)，其次通过分化培养直接再生植株，而不经过愈伤组织诱导步骤，大大缩短再生体系的时间，解决牡丹离体再生周期长、步骤多的问题；同时，外植体可直接分化出分生结节，而不经过愈伤组织诱导，可极大程度缩短牡丹愈伤组织诱导分生结节离体再生体系的周期。

7、优选地，对于芽叶组织，直接分化培养基包括：wpm组培基本培养基、0.8-1.2mg/lcppu以及0.2-0.5mg/l tdz。

8、在上述分化培养基进行培养，芽叶组织分化率可达66.67％。

9、优选地，对于分生结节，直接分化培养基包括：wpm组培基本培养基、0.4-0.6mg/lcppu以及0.2-0.5mg/l tdz。

10、在上述分化培养基进行培养，分生结节诱导率可达41.67％。

11、所述继代培养不进行切割。

12、优选地，继代培养5-6次，继代培养周期为14-16天。

13、在一些实施方案中，所述牡丹的子叶的获取方法包括：

14、将牡丹种子中的种胚在萌发培养基中培养10-20天后获得；

15、所述萌发培养基包括：ms组培基本培养基、0.4-0.8mg/l ba以及0.8-1.2mg/lga3。

16、优选地，牡丹种子为花后85～95天的种子。

17、在一些实施方案中，所述接种的方式为近轴面向上的方式。

18、优选地，将子叶切割成0.8-1.2cm×0.8-1.2cm大小的方块，以近轴面向上的接种方式接种。

19、在一些实施方案中，接种于诱导培养基中诱导10-15天后，选择未诱导出愈伤组织的外植体置于直接分化培养基中继代培养。

20、优选地，接种于诱导培养基中诱导10-15天后，选择未诱导出愈伤组织的子叶置于直接分化培养基中继代培养。

21、在一些实施方案中，再生的方法还包括：

22、置于直接分化培养基中继代培养5-6次，培养周期为14-16天，获得诱导分化出芽叶组织的外植体；和/或，

23、置于直接分化培养基中继代培养5-6次，培养周期为14-16天，获得含有分生结节和/或丛生结节的外植体，然后置于分生结节分化培养基中培养3-4次，培养周期为9-11天，获得诱导分化出芽叶组织的结节；

24、所述分生结节分化培养基包括：wpm组培基本培养基、0.4-0.8mg/l cppu以及0.3-0.8mg/l tdz。

25、在一些实施方案中，再生的方法还包括：

26、将诱导分化出芽叶组织的外植体和/或诱导分化出芽叶组织的结节置于不定芽诱导与伸长培养基中继代培养2-3次，培养周期28-30天，获得茎长≥1cm的伸长不定芽；

27、所述不定芽诱导与伸长培养基包括：wpm组培基本培养基、0.2-0.4mg/l ba以及0.15-0.3mg/l ga3。

28、在一些实施方案中，再生的方法还包括：

29、将茎长≥1cm的伸长不定芽先在2-6℃冷处理6-10天，然后接种在生根诱导培养基中置于黑暗条件下诱导生根，再转接到根形成培养基中于光照条件下培养，获得生根试管苗；

30、所述生根诱导培养基包括：1/2ms组培基本培养基、0.8-1.2mg/l iba以及0.8-1.2mg/l腐胺；

31、所述根形成培养基包括：1/2ms组培基本培养基和0.3-0.6g/l ac。

32、在一些实施方案中，牡丹外植体直接植株再生的方法包括：

33、(1)将牡丹种子中的种胚在萌发培养基中培养10-20天后获得牡丹子叶外植体；所述萌发培养基包括：ms组培基本培养基、0.4-0.8mg/l ba以及0.8-1.2mg/l ga3；

34、(2)将牡丹子叶外植体以近轴面向上的方式接种于诱导培养基中诱导10-15天，选择未诱导出愈伤组织的外植体，然后置于直接分化培养基中继代培养；

35、所述诱导培养基包括：ms组培基本培养基、0.4-0.8mg/l tdz以及0.8-1.5mg/lnaa；

36、所述直接分化培养基包括：wpm组培基本培养基、0.4-1.2mg/l cppu以及0.2-0.5mg/l tdz；

37、(3)置于直接分化培养基中继代培本文档来自技高网...

【技术保护点】

1.一种牡丹外植体直接植株再生的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牡丹的子叶的获取方法包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种的方式为近轴面向上的方式。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种于诱导培养基中诱导10-15天后，选择未诱导出愈伤组织的外植体置于直接分化培养基中继代培养。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括：

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，还包括：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牡丹为‘凤丹’、‘高原圣火’、‘GoldenEra’中的至少一种。

10.权利要求1～9中任一项所述的方法在牡丹育种中的应用。

【技术特征摘要】

1.一种牡丹外植体直接植株再生的方法，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述牡丹的子叶的获取方法包括：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述接种的方式为近轴面向上的方式。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，接种于诱导培养基中诱导10-15天后，选择未诱导出愈伤组织的外植体置于直接分化培养基中继代培养。

5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐莉，黎可欣，范成成，
申请(专利权)人：湖北民族大学，
类型：发明
国别省市：

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