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抗烟草花叶病毒的纳米制剂及其制备方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-11-23 11:17

本发明涉及一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂及其制备方法，属于基因工程。

背景技术：

1、病毒病给烟叶安全生产造成了严重威胁，其中烟草普通花叶病毒(tobaccomosaic virus,tmv)和烟草脉带花叶病毒(tobacco vein banding mosaic virus,tvbmv)引起的病症十分相似，难以区分，且发病严重，每年给烟叶生产造成巨大损失，严重威胁烟叶产业的可持续发展。目前烟草病毒病的防治策略以预防为主，治疗为辅，无法根治。且烟草收获器官为叶片，一旦叶片染病，将直接影响烟叶产量和品质。因此，探索新的绿色、安全、高效的防治技术迫在眉睫。

2、近年来，纳米颗粒(nanoparticle，np)介导的rnai已被开发为一种很有前途的植物病虫害防治手段。纳米颗粒介导的dsrna递送系统在提高rnai效率方面具有突出的优势。在大多数情况下，纳米颗粒的阳离子基团可通过静电相互作用与dsrna的磷酸基团结合形成dsrna/纳米颗粒复合物。壳聚糖(chitosan，cs)、碳量子点(carbon quantum dots,cqds)、石墨烯量子点(graphene quantum dots，gqds)等已成功应用于生物工程dsrna研究领域。如利用cs，cqd和lipofectamine2000与靶向甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(g3pdh)的dsrna结合对水稻二化螟(chilo suppressalis)有较好的防治效果；利用壳聚糖季铵盐(chitosan quaternary ammonium salt，cqas)、胺化二氧化硅纳米粉体(aminefunctionalized silica nano powder，asnp)和碳量子点(cqd)，递送靶向pvy病毒的dsrna，结果表明cqd-dsrna效果最好，可以在喷施后21d内保护系统叶片。尽管纳米颗粒介导的dsrna递送系统在其它植物病虫害防治方面取得良好效果，但对于该制剂在烟草普通花叶病毒(tobacco mosaic virus,tmv)和烟草脉带花叶病毒(tobacco vein bandingmosaic virus,tvbmv)防治应用少有研究。而鉴于烟草普通花叶病毒(tmv)和烟草脉带花叶病毒(tvbmv)引起的病症十分相似，难以区分，且发病严重，因此，研究基于烟草普通花叶病(tmv)和烟草脉带花叶病毒(tvbmv)的基因组序列利用vigs技术筛选高效沉默的dsrna靶点序列，体外合成dsrna并构建dsrna纳米递送体系，为烟草病毒病的防治具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、鉴于此，本发明的目的是提供一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂及其制备方法，以至少解决背景技术提到的问题。

2、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

3、一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂，由dsrna和纳米材料组成，

4、所述dsrna为基于烟草普通花叶病(tmv)和烟草脉带花叶病毒(tvbmv)的基因组序列，利用vigs技术筛选高效沉默的dsrna靶点序列得到的体外合成物，其基因序列如seq idno.1～4所示；

5、所述纳米材料为壳聚糖(chitosan，cs)、碳量子点(carbon quantum dots,cqds)、石墨烯量子点(graphene quantum dots，gqds)中的一种。

6、进一步地，所述dsrna和纳米材料壳聚糖(cs)、碳量子点(cqds)、石墨烯量子点(gqds)的组合比例为：

7、dsrna:cs＝1:1；

8、dsrna:cqds＝1:10；

9、dsrna:gqds＝1:7。

10、一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂的制备方法，包括以下步骤：

11、s1、根据tmv和tvbmv基因组序列选定p126、tmv-cp、tvbmv-cp、hc pro片段设计含载体同源15bp的引物对tmv和tvbmv基因组进行pcr扩增反应，筛选高效沉默的dsrna靶点序列；

12、s2、在所述的靶点序列前加t7启动子序列，进行体外转录制备dsrna；

13、s3、构建dsrna纳米递送体系。

14、进一步地，步骤s1中，所述dsrna靶点序列如seq id no.5～12所示。

15、进一步地，步骤s2中，t7子序列为

16、attctctagaagcttaatacgactcactataggg。

17、进一步地，dsrna合成引物序列为seq id no.21～28。

18、进一步地，步骤s3中，进行纳米材料-dsrna的合成，具体为：

19、cs-dsrna的制备：称取壳聚糖cs 0.2g，用0.1％乙酸溶解定容至100ml，得到2mg/ml壳聚糖溶液，按照不同比例将dsrna与壳聚糖溶液混匀，涡旋震荡1分钟，静置30min，得到cs-dsrna溶液；dsrna与cs的融合设置不同比例，琼脂糖凝胶电泳检测融合效果，筛选最佳融合比例；

20、cqds-dsrna的制备：称取0.02g碳量子点(cqds)，用10ml depc水溶解，得到2mg/mlcqds溶液，按照不同比例将dsrna与cqds溶液混匀，涡旋震荡1分钟，静置30min，得到cqds-dsrna溶液；dsrna与cqds的融合设置不同比例，琼脂糖凝胶电泳检测融合效果，筛选最佳融合比例；

21、gqds-dsrna的制备：按照不同比例将dsrna与石墨烯量子点(gqds)溶液混匀，涡旋震荡1分钟，静置30min，得到gqds-dsrna溶液；dsrna与gqds的融合设置不同比例，琼脂糖凝胶电泳检测融合效果，筛选最佳融合比例。。

22、与现有技术比较，本发明的有益效果是：

23、本发明基于烟草普通花叶病(tmv)和烟草脉带花叶病毒(tvbmv)的基因组序列利用vigs技术筛选高效沉默的dsrna靶点序列，体外合成dsrna，并通过将dsrna与不同纳米材料进行融合制得抗烟草花叶病毒的纳米制剂，该纳米制剂对tmv和tvbmv具有良好的防治效果，结果表明，不同纳米制剂注射对tmv和tvbmv的发病均有较好的抑制效果，发病抑制率均在99％以上。通过对tvbmv-cp基因表达量的检测可知，cqd-dsrna对tmv的平均抑制率为99.50％；gqd-dsrna对tmv的平均抑制率为98.51％；cs-dsrna对tvbmv的平均抑制率为99.67％；cqd-dsrna对tmv的平均抑制率为99.97％；gqd-dsrna对tmv的平均抑制率为99.99％。

24、本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

技术特征：

1.一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，由dsrna和纳米材料组成，

2.权利要求1所述抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，所述dsrna和纳米材料壳聚糖（cs）、碳量子点（cqds）、石墨烯量子点（gqds）的组合比例为：

3.一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.权利要求3所述抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，步骤s1中，所述dsrna靶点序列如seq id no .5～12所示。

5.权利要求3所述抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，步骤s2中，t7子序列为attctctagaagcttaatacgactcactataggg。

6.权利要求5所述抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，dsrna合成引物序列为seqid no.21～28。

7.权利要求1所述抗烟草花叶病毒的纳米制剂，其特征在于，步骤s3中，进行纳米材料-dsrna的合成，具体为：

技术总结
本发明公开了一种抗烟草花叶病毒的纳米制剂及其制备方法，其基于烟草普通花叶病（TMV）和烟草脉带花叶病毒（TVBMV）的基因组序列利用VIGS技术筛选高效沉默的dsRNA靶点序列，体外合成dsRNA，并通过将dsRNA与不同纳米材料进行融合制得抗烟草花叶病毒的纳米制剂，该纳米制剂对TMV和TVBMV具有良好的防治效果，结果表明，不同纳米制剂注射对TMV和TVBMV的发病均有较好的抑制效果，发病抑制率均在99%以上。

技术研发人员：张盼,余永旭,郭玉双,贾蒙骜,尹国英
受保护的技术使用者：贵州省烟草科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/7/11