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In silico cloning and bioinformatics analysis of cyclophilin from Lotus corniculatus

来源：花匠小妙招时间：2024-11-20 17:07

黑龙江中医药大学药学院, 黑龙江哈尔滨 150040

收稿日期: 2016-03-19

基金项目: 国家自然基金资助项目（81274010）；黑龙江省杰出青年基金（JC201101）；黑龙江中医药大学“优秀创新人才支持计划”（2012001）；哈尔滨市优秀学科带头人基金（2014RFXXJ122）；黑龙江省教育厅科学技术研究项目（12541743）

作者简介: 闫嵩(1989-), 男, 在读硕士研究生, 研究方向为药用植物生物工程。E-mail:zleztme@163.com

通信作者: 马伟, 女, 研究员, 博士生导师, 研究方向为药用植物生物工程。Tel:(0451)82193430, E-mail:mawei@hljucm.net

摘要:目的通过电子克隆技术对百脉根细胞亲环素（cyclophilin）基因进行预测。方法以大豆cyclophilin序列为探针，基于NCBI中百脉根的EST数据库和CAP3在线软件进行序列拼接，利用生物信息学数据库及相关软件对其结构和功能进行预测分析。结果百脉根cyclophilin基因全长1 346 bp，包含771 bp的开放阅读框，编码256个氨基酸，该蛋白为亲水性蛋白。结论为进一步解释基因的分子功能奠定理论及实验基础。

In silico cloning and bioinformatics analysis of cyclophilin from Lotus corniculatus

Abstract:ObjectiveUsing electronic cloning technology to predict cyclophilin gene of Lotus corniculatus.MethodsUsing glycine max cyclophilin sequence as probe sequence, based on EST sequence from NCBI and assembled by CAP3 sequence assembly programme, using bioinformatic database and related software, the structure prediction and function analysis were performed.ResultsThe full length of cyclophilin gene was 1 346 bp, it contained a 771 bp ORF, encoding 256 amino acids, and the protein was a hydrophilic protein.ConclusionThe study is intended to further explain the molecular genetic function theory and experimental basis.

Key words:Lotus corniculatus L. cyclophilin in silico cloning bioinformatics molecular function

电子克隆（in silico cloning）是近年来伴随着基因组计划和EST计划发展起来的基因克隆方法。电子克隆技术是通过序列的拼接和组装，克隆新基因的技术，具有高效、快速、投入低，并可以为实验克隆提供精准的参考序列等优点[1-3]。

百脉根Lotus corniculatus L.别名黄花草、牛角花等，是豆科百脉根属多年生草本植物，以全草入药。具有清热解毒、止咳平喘的功效。同时，百脉根也可用于防止水土流失及优良的豆科牧草[4-5]，广泛应用于中医药、环保及畜牧业等行业。

细胞亲环素（cyclophilin）是能够与免疫抑制剂环孢霉素A特异结合，普遍存在于细菌、真菌、植物和动物等有机体中的一个较大的蛋白家族，具有肽脯氨酰顺反异构酶活性，能够催化脯氨酸肽键的顺反异构化[6-8]。此外，在植物中细胞亲环素促进HSP90调节RNA诱导沉默复合体的装配，同时在细胞分裂、转录调节、信号转导及胁迫应答等多种生理过程中发挥重要作用[9]。目前，已有对水稻[10]、小麦[11]、水芹[12]、大豆[13]、棉花[14]、茶树[15]等经济类作物细胞亲环素的研究，而在中药方面的研究报道甚少。

1 材料与方法1.1 电子克隆获得新基因序列

以大豆AtCYP20-2基因（BW675370）作为探针，序列使用Blastn工具检索NCBI中百脉根EST序列，得到与探针序列同源性较高的百脉根EST序列，使用在线工具CAP3[16]进行拼接，以拼接好的重叠群（Contig）为探针，再次Blast检索，直到没有新的EST序列可供拼接，Contig不能延伸为止。

1.2 生物信息学分析

基于在线生物信息学软件对新基因序列进行分析。本研究对该基因进行开放阅读框分析、理化性质分析、结构预测、信号肽分析、亲疏水性分析、亚细胞定位预测。本研究在线分析工具见表 1。

表 1 生物信息学预测项目及相关网站 Table 1 Bioinformatic prediction and websites

2 结果与分析2.1 新基因的识别

以大豆细胞亲环素基因作为探针，利用NCBI中百脉根EST数据库进行Blastn搜索，将得到的EST序列使用CAP3进行拼接，获得1条全长为1 346 bp的Contig。通过ORF Finder软件分析结果显示，其开放阅读框长度为771 bp，编码256个氨基酸，见图 1。

图 1 百脉根细胞亲环素基因电子克隆cDNA序列和编码氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and coding amino acid sequence of cyclophilin in L. corniculatus using in silico cloning

2.2 百脉根细胞亲环素基因编码氨基酸一级结构预测

通过在线软件ProtParam，基于蛋白质数据库，对百脉根细胞亲环素基因编码的氨基酸的一级结构预测见表 2。

表 2 百脉根细胞亲环素蛋白的一级结构预测分析 Table 2 Primary structure analysis of cyclophilin in L. corniculatus

2.3 百脉根细胞亲环素信号肽预测和分析

采用SignaIP4.1 Server[17]，预测百脉根细胞亲环素的信号肽，结果如图 2和表 3。基因所编码的蛋白质在氨基酸序列的26位置上有一个潜在的信号肽断裂位点，概率为0.189。由于氨基酸残基的原始剪切位点和信号肽的分值均较小，可推测该基因所编码的蛋白可能不存在信号肽，为非分泌蛋白，该蛋白在细胞质中合成后，不进行蛋白转运。

图 2 百脉根细胞亲环素信号肽预测结果Fig.2 Signal P-NN prediction for cyclophilin in L. corniculatus

表 3 百脉根细胞亲环素信号肽预测 Table 3 Signal peptide prediction for cyclophilin in L. corniculatus

2.4 百脉根细胞亲环素蛋白疏水性/亲水性分析

利用ProScale在线软件，对百脉根细胞亲环素编码的氨基酸进行亲疏水性预测。根据正值越大表示蛋白疏水性越强，负值越大表示蛋白亲水性越强，介于+0.5～−0.5的主要为两性氨基酸的规律，预测结果如图 3。因此推测细胞亲环素编码的蛋白为亲水性蛋白质[18]。

图 3 百脉根细胞亲环素信号肽预测Fig.3 Signal peptide prediction for cyclophilin in L. corniculatus

2.5 百脉根细胞亲环素蛋白的二级结构预测

蛋白质二级结构是指蛋白质分子中某一段肽链的局部空间结构，也就是该段肽链主链骨架原子的相对空间位置，并不涉及氨基酸残基侧链的构象[19]。通过在线软件SOPMA[20]，基于蛋白数据库，对百脉根细胞亲环素蛋白进行二级结构预测见图 4，结果表明该蛋白质的二级结构主要由4种形式组成，即由无规卷曲占42.19%，延伸链占28.52%，α-螺旋占19.53%，β-折叠占9.77%。据此推测，无规卷曲是百脉根细胞亲环素蛋白二级结构中最大量的结构元件。

图 4 百脉根细胞亲环素蛋白二级结构预测分析Fig.4 Secondary structure prediction of cyclophilin protein

2.6 百脉根细胞亲环素蛋白质跨膜结构预测

对于跨膜结构域的预测和分析，有助于对蛋白的结构和功能以及其他基本信息的理解。采用在线跨膜蛋白结构预测TMpred软件，对该蛋白氨基酸的跨膜结构域进行预测的结果见图 5。依据图 5可发现有2处跨膜结构域分别是1～17、181～200氨基酸位置。但一般将纵坐标分值大于500被认为是可能性较高的跨膜结构域，1～17处的跨膜结构域的分值为803，而181～200处的跨膜结构域的分值仅为77，据此推测仅有1处跨膜结构域即1～17处的跨膜结构域。

图 5 基于TMpred软件预测蛋白质的跨膜区域预测Fig.5 Predicted transmembrane domains of deduced amino acid sequence by TMpred software

2.7 百脉根细胞亲环素蛋白的亚细胞定位

使用Psort在线软件[21]，基于蛋白数据库，对百脉根细胞亲环素蛋白进行亚细胞定位。蛋白质在细胞内定位是了解蛋白生物学功能的基础，存在于不同位置，相应的靶蛋白的定位过程也不同。结果显示该蛋白在细胞质的概率最大，达到60.9%，在线粒体的概率是26.1%，在细胞核的概率是8.7%，在细胞液中有4.3%的概率，说明百脉根细胞亲环素蛋白可能位于细胞质中。

2.8 百脉根细胞亲环素蛋白质功能分类预测和分析

通过CBS的Protfun软件预测编码蛋白的功能[22]，其功能分类如表 4。该蛋白为酶蛋白，根据酶的分类，很可能属于转运蛋白。电压门控离子通道功能的概率最高为0.279。据此推断该蛋白是一种在电压门控离子通道中起转运作用的转运蛋白。

表 4 百脉根细胞亲环素蛋白的功能预测 Table 4 Functions prediction of cyclophilin protein

2.9 百脉根细胞亲环素蛋白质三级结构预测

蛋白质三级结构指整条多肽链中全部氨基酸残基的相对空间位置，也就是整条肽链所有原子在三维空间的排布位置。将百脉根细胞亲环素编码的蛋白质序列提交至SWISS-MODEL在线软件[23]，采用同源建模法，见图 6。该蛋白主要由无规卷曲、α-螺旋、β-折叠组成，基本与二级结构预测结果一致。

图 6 百脉根cyclophilin蛋白质空间构象模拟图Fig.6 Confonnation simulated maps of cyclophilin protein

3 讨论

电子克隆最初是随着人类基因组和EST计划而产生和发展的。与传统的基因克隆方法相比，电子克隆主要有以下优点：速度快、成本低、技术要求低、常规设备即可、针对性强[24]。电子克隆在植物基因克隆中也起到不可替代的作用，随着转录组、基因组等生物信息的丰富，电子克隆技术将会在药用植物种质资源等方面具有广阔的应用前景[25]。

通过电子克隆得到百脉根细胞亲环素基因并进行生物信息学分析，推测该基因的开放阅读框长度为771 bp，编码256个氨基酸。编码的蛋白为亲水性蛋白，亚细胞定位显示可能位于细胞质中，二级结构中最大量的结构元件是无规卷曲，该蛋白在电压门控离子通道中起转运作用。电子克隆虽然在基因克隆效率上有很大的优势，但也存在一些弊端。一方面受到已有的EST数目的限制，同时电子克隆不适用于种间保守性差的基因和外显子数目多而且每个外显子短的基因，使得电子克隆技术应用的普遍性受到一定程度的限制[3]。由于生物大分子结构与功能的复杂性，很多分析软件的输出结果存在偏差，因此通过生物信息学软件对相关基因电子克隆的分析结果仍然需要通过实验来进行验证。本研究为百脉根cyclophilin基因的实验克隆及功能验证提供理论基础，同时也为电子克隆技术在中药的育种及基因修饰等方面提供参考。

参考文献

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