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病原物分离培养实验报告讲解

来源：花匠小妙招时间：2024-11-13 10:52

病原物分别培养和纯化普通植物病理学题目病原物的分别培养和纯化姓名学号所在学院农学院年级专业植物保护201201 指导教师达成时间年月日 1 病原物分别培养和纯化病原物的分别培养和纯化植物保护指导教师【纲要】本实验主要经过用对十大功绩炭疽病病菌的分别和在PDA培养基中对炭疽病菌消毒后做无菌培养然后转移到斜面培养的实验过程察看炭疽病菌的生长情况，认识分别与纯化病原物的基来源理与方法，掌握实验室常用的消毒灭菌方法，并掌握培养基的制作和无菌操作技术。【重点字】分别培养；纯化；PDA培养基；灭菌；斜面试管培养基柯赫氏法例(Koch’sRule)是确定侵染性病害病原物的操作程序。如发现一种不熟悉的或新的病害时，就应按柯赫氏法例的四个步骤来达成诊疗与判定。诊断是从症状等表型特点来判断其病因，确定病害种类。判定则是将病原物的种类和病害种类同已知种类比较异同，确定其科学名称或分类上的地位。有些病害特征显然，可直接诊疗或判定，如霜霉病或秆锈病。但在很多场合难以判定病原物的属、种。如花叶症状易于辨别，要判断由何种病原物惹起，就必须经详尽判定比较后才能确定。柯赫氏法例表述为：“(1)在病植物上常陪伴有一种病原微生物存在；(2)该微生物可在离体的或人工培养基上分别纯化而获得纯培养；(3)将纯培养接种到相同品种的健株上，出现症状相同的病害；(4)从接种发病的植物上再分别到其纯培养，性状与接种物相同”【1】。如果进行了上述四步判定工作获得确实的凭证，就能够确认该微生物即为其病原物。材料与方法 1.1材料 1.1.1供试材料十大功绩炭疽病病害部位、PDA培养基（自制） 1.1.2试验试剂及仪器超净工作台、培养箱、培养皿、试管、接种铲、接种针、70%酒精、0.1升汞、电炉等 1.2方法（大田苗圃判定） 1.2.1培养基的配制 2 病原物分别培养和纯化 “培养基按成分及对成分认识程度分为天然培养基、半组合培养基、组合培养基三类，从物理性分为固体培养基、液体培养基两种，培养基不同，配制方【1】本实验采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，简称 PDA培养基。（PDA培养法不同。” 基是植物实验室最常用的培养基，主要用于植物病原真菌的分别培养。）PDA培养基的配制方法：首先准备优质去皮马铃薯 200克、葡萄糖10-20 克、琼脂20 克，加水至1000ml。将马铃薯切成小块，加水1000ml煮沸约半小时，煮沸过程中要不断搅拌，然后用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入小块琼脂，加热融化，再加糖，待完全溶化后，趁热分装于三角瓶和试管中，注意每个三角瓶不宜装太多，以少于1/2为宜，试管中用于制备斜面培养基，也应较少，1/3左右为宜，然后将三角瓶和试管塞好棉塞以备灭菌。由于PDA略带酸性，适于真菌生长，因此不用调节pH值。 1.2.2灭菌为了获得某种病原物的纯培养，用于培养病原物的器物和培养基必须经过灭菌才能使用。灭菌前在三角瓶中加入少许孟加拉红抑制细菌和放线菌的生长。本实验采用高压蒸汽灭菌法对做好的PDA培养基和试管内斜面培养基灭菌。高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它是利用高压提高蒸汽温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下： A、关好清水阀门，放入清水至标准度为止注意水量要加足，否则易造成事故。 B、将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上气盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度，不要太紧，再旋紧相对的两个旋钮，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气不能彻底灭菌。 C、通电加温，同时翻开排气阀门排尽锅内的空气，当活门喷出的全是蒸汽的时候即可封闭阀门，一定要排尽空气以达到彻底灭菌的目的，往常温度表上涨至90℃时翻开放气降至零点再封闭。 D、温度表的指针上涨时压力也随之升高，当压力表升至15磅时蒸汽压相当于一个大气压，此时计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，就能达到完全灭菌目的，然后停止加温。 E、一般应待压力表降至5磅时稍微翻开排气活门，使锅内蒸汽迟缓清除， 3 病原物分别培养和纯化然后加大活门开口，勿使排气过快。 F、当压力表降至0时锅内蒸汽完全排尽时，翻开锅盖取出培养基。然后将高压锅内水排出。 G、抽取上述培养基放入25℃恒温箱中，48小时不见杂菌证明培养基已达到目的。有些培养基经高温灭菌后容易失去营养成分，则可采用间歇性蒸汽灭菌法，即每日保持100℃一个小时连续三天也可达到灭菌效果。 1.2.3病原真菌的分别培养为了获得分别菌的纯培养，必须进行分别菌的纯化，本实验采用组织分别法分别炭疽病菌。分别培养一般在超净工作台上进行，无菌室和无菌箱要经过喷雾除尘，并用紫外线照射消毒，工作前将所需物品放在超净工作台内，操作人员需用肥皂洗手，操作时还需用7