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一种红花檵木叶片总RNA的提取方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-08-22 17:06

本发明属于植物组织rna提取技术领域，尤其涉及一种红花檵木叶片总rna的提取方法。

背景技术：

目前，业内常用的现有技术是这样的：

红花檵木(loropetalurnchinensevar.rubrum)别名红桎木、红檵花、红继木，为金缕梅科(hamamelidaceae)檵木属檵木的变种，属常绿灌木或小乔木，主要分布于长江中下游及以南地区，特产于湖南与江西交界罗霄山脉腹部浏阳和酸陵区域。红花檵木枝繁叶茂，花团锦簇，花红叶红，树态多姿，发枝力强，生态适应性强，繁殖快，栽培管理容易，耐修剪及耐蟠扎整形，可以作桩景、色雕、色篱、灌木球与植物造型，是现代园林色彩布置中优良的彩叶植物。生产上经不断栽培应用及苗农们的积极引种繁殖，已出现了许多叶形、叶色、花色、花形等不同的变异类型。

红花檵木在春季新叶初发时，花红叶红，叶片红艳可人，具有很高的观赏价值。但随着叶龄的增大，叶色发生较大变化，在初夏叶色变为暗红色，到了盛夏高温季节，叶色几乎变成了绿色，出现了生产上称之的“高温返青”现象。叶色的这种变化降低了红花檵木的观赏价值，对红花檵木的生产和销售也带来了很大影响。因此，探讨红花檵木叶色变化的原因，防止返青现象，对提高其观赏价值和进行新的叶色品种选育具有很大的理论和实践意义。

目前，红花檵木在叶色表型上主要有嫩叶红、透骨红、双面红、花叶等类型。同一叶色表型不同基因型红花檵木在夏季同样的栽培管理条件下叶色表型也存在较大的差异。关于红花檵木叶片呈色机理的阐述主要是与环境的关联方面，尚未深入到分子层面，目前还不能从分子水平对其叶片呈色的机理进行阐释。现代生物技术的迅猛发展，迫切需要对其进行叶色遗传改良和人为调控，红花檵木叶片呈色的丰富度具有很强的代表性。因此，从分子水平深入研究红花檵木叶片呈色，其叶片花色素合成相关基因的表达特性、叶片呈色分子机理及叶色的遗传改良一直是相关研究者非常关注的问题，对解析部分观赏植物丰富的叶色、阐释叶片呈色的机理、创造更多叶色丰富的观赏植物具有重要意义。

核糖核酸(rna)是分子生物学研究的重要材料之一，提取高质量的rna分子生物学研究的基本手段和必要前提，要进行northern杂交分析，rt-pcr，纯化mrna以及用于蛋白质体外翻译，建立cdna文库，pcr分析及基因克隆等分子生物学的研究，都需要高质量的rna。红花檵木的叶片呈色与类黄酮类色素花色素苷的含量分布密切相关，查尔酮合酶(chalkonesynthase，chs)是进入类黄酮和花色素苷次生代谢的第一个关键酶。通过试验筛选适于红花檵木总rna的提取方法，获得高质量的总rna，为深入进行红花檵木的分子生物学研究克隆chs基因奠定基础，也为其他彩色叶树种的总rna提取方法提供参考。获得高质量的总rna更便于后续进一步克隆出花青素合成酶(anthocyanidinsynthase,ans)和二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonolreductase,dfr)，为揭示影响叶色表达的主要物质、花青苷的生物合成和调控机制奠定基础，为红花檵木人工调控叶色与叶色的定向遗传改良提供参考。

国内外研究现状

近年来，关于红花檵木的研究报道较多，主要研究集中在种质资源的调查、形态学的分类、栽培与管理、新品种的选育、生物学特性、细胞学、分子标记、色素提取、园林应用等方面。随着科技的不断发展，红花檵木的种质资源由最初的形态学性状研究和生物学特征研究逐步深入到新品种的选育与园林应用，分子机理等研究领域，并在不断的探索与充实。唐前瑞等对红花檵木叶色变化生理生化进行研究，从叶绿素、类胡萝卜素、花色素苷、苯丙氨酸解氨酶及可溶性糖含量方面对红花檵木叶色变化的原因进行了探讨。李达等建立红花檵木srap反应体系并优化，对红花檵木dna提取方法以及srap-pcl反应体系的影响因子进行了初步探讨，筛选和建立了扩增多态性高、重复性好、带型清晰的dna模板和srap-pcr反应体系，同时提出了应用srap分子标记构建的红花檵木遗传图谱的可行性。选取红花檵木rsap-pcr最优反应体系为：在25μl的反应体系中，模板量70ng，mg2+浓度1.50mmol/l，dntps浓度0.25mmol/l，引物浓度0.20mmol/l，taq酶量2.50u。许威等成功克隆出红花檵木chs基因并对其进行序列分析，根据植物查尔酮合成酶保守区序列设计引物，以红花檵木大叶红的嫩叶为材料，用rt-pcr方法，分离得到了一个查尔酮合成酶基因的cdna，将该基因命名为lcvrchs1。张力进行了红花檵木叶色变化的基因表达差异分析与内参基因的筛选，对红花檵木颜色变化前后的叶片进行了cdna-srap分析，筛选出1个特异表达差异片段；对红花檵木叶片chs、dfr、ans三个花色素苷合成相关基因的表达进行了初步分析；选择了gapdh和β-actin作为红花檵木叶色相关基因real-timert-pcr分析的内参基因。

目前，已有许多关于植物总rna提取的研究，最常用的有异硫氰酸胍法，ctab法，sds-苯酚法及各种试剂盒法等。昌艳萍等建立了香花槐各组织总rna提取的最佳方法，提出叶与茎适合用改良ctab法提取，根皮适合用改良trizol试剂法加pvp提取；张琰等比较了不同的提取方法对血红鸡爪槭叶片总rna的提取效果，采用改良ctab法提取的总rna纯度很高，电泳图清新，经rt-pcr获得了清新的特异性条带；史宝胜等对富含花青素类物质的紫叶李叶片总rna提取方法进行改进和比较，用改良的ctab法能提取到高质量的总rna；谢吉容等以富含类黄酮的月季花瓣为试验材料，通过比较不同方法，优化和改进提取步骤，发现ctab多级沉淀法、改良异硫氰酸胍法提取的rna的完整性和纯度较好；陈美霞等用ctab法、热硼酸发、sds法、trizol法和商品化试剂盒5种方法提取‘红麻福红922’品种幼嫩叶片总rna，并对各方法提取效果进行比较，结果为采用热硼酸提取的红麻叶片总rna能够成功的进行反转录和制备cdna，效果最佳。

目前已有许多种植物关于总rna提取方法研究报导，但由于植物组织本身的特异性，不同的研究材料，甚至同一材料不同发育阶段rna的提取方法也不尽相同，均要根据试验所需建立适宜的rna提取方法。又由于红花檵木为彩色叶植物，含有较高含量的花色素苷、多糖及次生代谢产物，尤其是花色素苷和多糖对核酸的提取产生了很多的困难，是提取高质量的核酸过程中难以去除的干扰成分。

由于木本植物的组成成分和结构与草木植物差异较大，用一般的植物rna提取方法提取它们的rna时，常常得不到rna或者rna产量很低，可能有两方面的原因：一是核蛋白与核酸未能有效分离；二是核酸未能充分溶解到提取液中，离心时与杂质一同沉淀丢失。

在提取木本植物rna时，材料在提取液中必须经过强烈的振荡或温浴才能提取出rna。因此，可以选择需温浴的方法，如ctab法。但许多提取方法都要求避免高温操作，因此，智能用剧烈振荡的方法进行rna的分离。在振荡前，提取液中应加入苯酚、氯仿等蛋白质变性剂树种不同要求振荡的时间不同，但一般不应小于2min。

综上所述，现有技术存在的问题是：

目前已有许多种植物关于总rna提取方法研究报导，但由于植物组织本身的特异性，不同的研究材料，甚至同一材料不同发育阶段rna的提取方法也不尽相同，均要根据试验所需建立适宜的rna提取方法。由于红花檵木为彩色叶植物，含有较高含量的多糖、花色素苷及次生代谢产物，尤其是多糖和次生代谢产物对核酸的提取产生了很多的困难，是提取高质量的核酸过程中难以去除的干扰成分。很多的困难，如多糖易与rna共沉淀形成难溶胶状物，而难以分离提取；次生代谢产物很容易与rna结合并与rna共同被抽提出来而阻碍具有生物活性的rna的分离等。

技术实现要素：

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种红花檵木叶片总rna的提取方法。

本发明是这样实现的，一种红花檵木叶片总rna的提取方法，所述红花檵木叶片总rna的提取方法包括：

第一步，准备红花檵木叶片，灭菌刀片切割成小片放入灭过菌的1.5ml离心管，液氮浸泡研磨成粉状；

第二步，加入植物总rna提取试剂0.5ml，平放离心管，室温放置5分钟；

第三步，离心，上清转入新的无rnase离心管；

第四步，加入0.1ml5mnacl，温和混匀；

第五步，加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀；

第六步，离心分钟，取上层水相转入新的无rnase离心管；

第七步，加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

第八步，离心，弃掉上清，加1ml75％乙醇；

第九步，离心，倒出液体，剩余的液体离心，然后用枪头吸出，室温晾干2分钟；

第十步，加50μldepc水，反复吹打、混匀，充分溶解rna；

第十一步，在50μlrna中加入10μlbufferrdd，2.5μldnase储存液，37.5μlrnase-freeddh2o在20℃～25℃孵育10min；

第十二步，加10μl20mm的edta，65℃孵育10min；将rna于-70℃保存。

进一步，所述第一步中灭菌刀片切割成重量为25～30mg；液氮浸泡离心管内叶片10s后以小杵研磨成粉状。

进一步，所述第二步中总rna提取试剂已添加β-巯基乙醇。

进一步，所述第三步中4℃12000rpm离心1分钟。

进一步，所述第六步中4℃12000rpm离心10分钟。

进一步，所述第八步中4℃12000rpm离心10分钟。

进一步，所述第九步中4℃5000rpm离心3分钟。

综上所述，本发明的优点及积极效果为：植物组织总rna的提取方法很多，但由于植物组织的特异性，不同材料甚至同一材料在不同发育阶段，其rna的提取方法也不尽相同.本发明以“长叶玫红”，“花叶2号”，“大叶红”及“玫红细叶青”四种不同类型的红花檵木为材料，针对红花檵木的特异性并通过长期实践，获取了适宜红花檵木的有效提取方法，植物总rna提取试剂(rnaplantplusreagent)提取。提取的红花檵木总rna纯度高，杂质少。

附图说明

图1是本发明实施例提供的红花檵木叶片总rna的提取方法流程图。

图2是本发明实施例提供的红花檵木叶片总rna的提取方法实现流程图。

图3是本发明实施例提供的琼脂糖凝胶电泳图。

图4是本发明实施例提供的‘花叶1号’总rna提取材料。

图5是本发明实施例提供的‘大叶红’总rna提取材料。

图6是本发明实施例提供的不同方法提取红花檵木总rna琼脂糖凝胶电泳检测图。

图中，a：植物总rna试剂提取法；b：sds酚法；c：transzolplant试剂盒法；d：柱式植物rnaout法；e：totalrnaisolationreagent试剂盒法；f：plantrnakit试剂盒法；g：trizol法；h：ctab法；i：改良ctab法。(注m:d2000，1：‘花叶1号’品种，2：‘大叶红’品种)。

图7是本发明实施例提供的不同抽提次数提取液颜色对比图。

图中，a：‘花叶1号’品种，b：‘大叶红’品种。

图8是本发明实施例提供的不同抽提次数提取总rna琼脂糖凝胶电泳检测图。

图中，a：抽提一次；b：抽提二次；c：抽提三次(注m：d2000，1：‘花叶1号’品种，2：‘大叶红’品种)。

图9是本发明实施例提供的特异引物rt-pcr扩增产物chs基因电泳图

图中：m：d2000，1：‘花叶1号’品种，2：‘大叶红’品种。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。

如图1、图2所示，本发明实施例提供的红花檵木叶片总rna的提取方法包括以下步骤：

s101：准备新鲜幼嫩红花檵木叶片，灭菌刀片切割成小片(重量约为25～30mg)放入灭过菌的1.5ml离心管，液氮浸泡离心管内叶片约10s后以小杵快速研磨成粉状；

s102：加入植物总rna提取试剂(已添加β-巯基乙醇)0.5ml，平放离心管，室温放置5分钟；

s103：4℃12000rpm离心1分钟，上清转入新的无rnase离心管；

s104：加入0.1ml5mnacl，温和混匀；

s105：加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀；

s106：4℃12000rpm离心10分钟，取上层水相转入新的无rnase离心管；

s107：加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10分钟；

s108：4℃12000rpm离心10分钟，弃掉上清，但不要倒出沉淀，加1ml75％乙醇；

s109：4℃5000rpm离心3分钟，倒出液体，但不要倒出沉淀，剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2分钟；

s110：加50μldepc水，反复吹打、混匀，充分溶解rna；

s111：在50μlrna中加入10μlbufferrdd，2.5μldnase储存液，37.5μlrnase-freeddh2o在20℃～25℃孵育10min；

s112：加10μl20mm的edta，65℃孵育10min。最后将rna于-70℃保存。

下面结合附图对本发明的应用效果作详细的描述。

红花檵木总rna的电泳图如图3所示(左边marker为d2000，标记条带分子量大小从上至下依次为2000、1000、750、500、250、100bp，1为“长叶玫红”材料、2为“花叶2号”材料、3为“大叶红”材料、4为“玫红细叶青”材料)。从图中可以看出rna的电泳条带清晰，可以用于后续试验。

下面结合具体实施例，对本发明所提方法的有效性进行验证。

实施例

1材料与方法

1.1材料

选取红花檵木园林广泛种植品种‘大叶红’(l.chinensevar.rubrum‘dayehong’)和最新选育品种‘花叶1号’(l.chinensevar.rubrum‘huayejimu1’)组织培养苗(见图4、图5)嫩叶为材料，材料从湖南农业大学园艺园林学花卉基地红花檵木‘大叶红’与‘花叶1号’中选取经组培所得。

1.2主要试剂和仪器

1.2.1主要试验仪器设备

kodakgellogic212凝胶成像系统，美国carestreamhealth公司；z323k高速冷冻型离心机，德国hermle公司；veriti96-welithermalcyclerpgr扩增仪，美国appliedbiosystems公司；dyy-12电泳仪，北京六一厂；xb70制冰机，美国grant公司；uv-1800紫外分光光度计，日本岛津公司。

1.2.2生化试剂

植物总rna提取试剂(rnaplantplusreagent)，天根生化科技(北京)有限公司；transzolplant试剂盒，北京全式金生物有限公司，easypuretmplantrnakit，北京全式金生物有限公司；柱式植物rnaout试剂盒，北京天恩泽基因科技有限公司；totalrnaisolationreagent试剂，长沙市迈科生物科技有限公司；trizol试剂盒，invitrogen公司；chs基因引物合成，invitrogen公司；β-巯基乙醇；nacl；氯仿；异丙醇；75％乙醇；rnase-freeddh2o；bufferrdd(tiangen)；dnase储存液；edta(ph8.0)；0.1％depc水；琼脂粉；d2000(tiangen)；goldviewi核酸染色剂(tiangen)；markⅲ(tiangen)；溴酚蓝(tiangen)；无水乙醇；kac；水饱和酚；licl；sds；tris-hcl(ph＝8.0)；pvp；catb；buffer(mg2+-plus)(tiangen)；dntps(tiangen)；taq聚合酶(tiangen)；rtm-mlv缓冲液；mmlv-rt；rna-inhibitor。

1.3方法

1.3.1总rna提取方法

(1)植物总rna提取试剂(rnaplantplusreagent)法；

1)准备新鲜幼嫩红花檵木‘大叶红’与‘花叶1号’品种叶片各100mg，灭菌刀片切割成小片(重量约为25-30mg)分别放入灭过菌的1.5ml离心管，液氮浸泡离心管内叶片约10s后小杵快速研磨成粉状。

2)加入植物中rna提取试剂(已添加β-巯基乙醇，4℃)0.5ml，振荡至彻底混匀，平放离心管，室温放置5分钟。

3)4℃12000rpm离心1min，上清转入新的无rnase离心管。

4)加入0.1ml5mnacl，温和混匀。

5)加入0.3ml氯仿，上下颠倒混匀。

6)4℃12000rpm离心10min，取上层水相转入新的无rnase离心管。

7)加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置10min；

8)4℃12000rpm离心10min。弃掉上清，但不要倒出沉淀。加lml75％乙醇。

9)4℃5000rpm离心3min。倒出液体，但不要倒出沉淀。剩余的少量液体短暂离心，然后用枪头吸出，室温晾干2-3min。

10)加入50μldepc水，反复吹打、混匀，充分溶解rna。如有絮状物，可以在室温下12000rpm离心1min，取上清转入干净的无rnase离心管中。

11)在50μlrna中加入10μlbufferrdd；2.5μldnase储存液；37.5μlrnase-freeddh2o在20℃-25℃孵育10min。

12)加10μl20mm的edta，65℃孵育10min。最后将rna于-70℃保存。

(2)sds酚法

本方法参照王暑辉侧柏叶片总rna提取改进sds酚法。

2)加入600sdsμl提取液取液[2％sds，25mmol/ledta，100mmol/ltris-hcl(ph8.0)，2％pvp]，和40μl巯基乙醇,混匀后再加入150μl无水乙醇和150μl3mol/l的kac,混匀。

3)4℃12000rpm离心15min，取上清,加入250μl水饱和酚和250μl氯仿,混匀后冰上放置10min。

4)4℃12000rpm离心15min，取上清，加入与上清液等体积的氯仿抽提，混匀后冰上放置10min。

5)4℃12000rpm离心15min，取上清，加入等体积异丙醇，混匀后冰上放置10min。

6)4℃12000rpm离心20min，弃上清，加入75％乙醇1ml，温和洗涤沉淀。

7)4℃12000rpm离心5min，弃上清，干燥后50μldepc水溶解rna。最后将rna样品于-70℃保存。

(3)transzolplant试剂盒法

2)加入1mltpi溶液，涡旋或用枪头吹吸数次，4℃12000rpm离心5min，小心吸取上清，将上清评分至两个新的1.5mlrnase-free离心管中(每管上清约400-500μl)。

3)向上清中加入等体积的tpii溶液(粉红色)，颠倒混匀数次，加入1/4上清体积的氯仿，再次颠倒混匀数次，室温孵育5min。

4)4℃12000rpm离心5min，此时溶液分为上清层(无色)、中间层(无色透明油状溶液约50μl)和有机层(粉红色)，rna分布在上清层中。

5)小心吸取上清于新的rnase-free离心管中，此时上清体积约为400-500μl。

6)向上清中加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温孵育10min。

7)4℃12000rpm离心10min。弃上清，此时在管侧和管底形成胶装沉淀。

8)加入1ml75％乙醇，剧烈涡旋。4℃10000rpm离心5min，弃上清，室温晾干沉淀，约5min。干燥后加入50μldepc水溶解rna。样品保存于-70℃。

(4)柱式植物rnaout试剂盒法

2)加入1ml溶液a，涡旋20s，4℃放置10min。在离心管中加入0.3ml的溶液b和0.2ml氯仿，振荡器上充分振荡30s混匀。

3)室温12000rpm离心5min。将上清(约0.6ml)转移到另一干净的1.5ml塑料离心管中，下层有机相和中间层含有dna、蛋白质和其他杂质，避免触及或吸取。

4)假如等体积的溶液c，充分颠倒混匀。将一半的溶液转移到离心吸附柱中，室温12000rpm离心30s，弃穿透液；将剩下的一半溶液转移到同一离心吸附柱中，室温12000rpm离心30s，弃穿透液。

5)加0.7ml通用洗柱液，室温12000rpm离心30s，弃穿透液。再加入0.3ml通用洗柱液，室温离心半分钟，齐穿透液。室温12000rpm离心30s。

6)将离心吸附柱转移到rnase-free收集管中，加入50rna洗脱液，室温放置2min。

7)室温12000rpm离心30s，离心管中溶液为rna样品，可以立即使用或存放于-70℃待用。

(5)totalrnaisolationreagent试剂法

2)加入1mltotalrnaisolationreagent试剂，混合均匀，室温放置5min。

3)4℃12000rpm离心10min，取上清。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温放置5min。

4)4℃12000rpm离心15min，小心吸取0.5ml上清转移到新管中，加入0.5ml的异丙醇，轻轻颠倒混匀，室温放置10min。

5)4℃12000rpm离心10min，小心去掉上清，离心后在管低和管侧出现胶状沉淀，加入0.25ml异丙醇和0.25ml无rnase的高盐溶液(0.8m柠檬酸钠和1.2mnacl)混合，室温放置10min。

6)4℃12000rpm离心10min，弃上清。加入1ml75％乙醇，4℃12000rpm离心5min，弃上清。短暂离心数秒，用吸头将剩余液体彻底吸掉。

7)室温放置5min干燥rna。加入25-200μl无rnase的水，用枪头吸打几次，55-50℃放置10min使rna溶解。-70℃保存。

(6)plantrnakit试剂盒法

2)加入1mlbb6和10μlβ-巯基乙醇，涡旋剧烈震荡混匀。室温孵育3min。4℃12000rpm离心5min，小心吸取离心管中的上清至rnase-free的离心管中。

3)向上清中加入0.5倍体积无水乙醇，混匀。涡旋彻底混匀，分散沉淀。将得到的溶液和沉淀一起加入离心柱中，4℃12000rpm离心30s，弃掉流出液。

4)加500μlcb6，室温12000rpm离心30s，弃掉流出液。

5)加500μlwb6，室温12000rpm离心30s，弃掉流出液。

6)重复步骤5一次。室温12000rpm离心2min，彻底去除残留的乙醇，在室温静置数分钟彻底晾干离心柱。

7)加入50μlrnase-freeh2o在离心柱的中央，室温静置1min。室温12000rpm离心2min，洗脱rna。将rna置于-70℃保存。

(7)trizol法

2)加入1mltrizol提取液，震荡混匀，冰上放置5min。

3)4℃12000rpm离心15min，取上清转入新离心管，加入200μl氯仿，混匀，冰上放置15min。

4)4℃12000rpm离心15min，取上清液。在上清液中加入上清液体积2/3体积异丙醇，混匀，冰上放置10min。

5)4℃12000rpm离心20min，rna沉于管底，弃上清。加入75％的乙醇1ml，温和洗涤沉淀。

6)4℃12000rpm离心5min，弃上清，冷冻干燥后，用50μldepc水溶解沉淀rna。将rna置于-70℃保存。

(8)ctab法

本方法参照王暑辉侧柏叶片总rna提取ctab法。

2)加入600μl65℃预热的ctab提取液[2％ctab，0.1mol/ltris-hcl(ph8.0)，25mmol/ledta(ph8.0),2mol/lnacl，2％pvp]和30μl巯基乙醇,振荡混匀,65℃水浴20min。

3)加入等体积的氯仿,混匀抽提5min。在4℃12000rpm离心10min，取上清。上清液中加入1/3体积8mol/l的licl,使licl终浓度为2mol/l，4℃放置过夜。

4)4℃12000rpm离心20min，弃上清,沉淀用500μl0.5％sds溶解，加入等体积氯仿抽提。

5)4℃12000rpm离心10min，取上清,加入无水乙醇使终浓度为70％，-20℃放置1h。

6)4℃12000rpm离心20min，弃上清,干燥后加入50μldepc水溶解沉淀。将rna置于-70℃保存。

(9)改良ctab法

本方法参照史宝胜紫叶李叶片总rna提取改良ctab法。

1)准备新鲜幼嫩红花檵木‘大叶红’与‘花叶1号’品种叶片各100mg，灭菌刀片切割成小片(重量约为25-30mg)分别放入灭过菌的1.5ml离心管，液氮浸泡离心管内叶片约10s后小杵快速研磨成粉状，研磨过程中加入0.1gpvpp。

2)加入600μl经65℃预热的ctab提取缓冲液[2％ctab，0.1mol/ltris-cl(ph＝8.0)，0.01mol/lnacl，25mmol/ledta(ph＝8.0)，使用前加入2％β-巯基乙醇]，立即用力上下颠倒并涡旋震荡30s，使材料均匀分散于溶液中，于65℃水浴锅中温浴5min，其间剧烈震荡3次。

3)稍冷却后加入等体积的氯仿/异戊醇涡旋震荡1min使之充分混匀，室温12000rpm离心15min；取上清，重复氯仿/异戊醇抽提一次。

4)转移上清液至另一离心管中，加入0.5倍体积的5mol/llicl，使终浓度为2mol/l，混匀，4℃沉淀过夜。

5)4℃12000rpm离心15min，去上清，用100μl70％乙醇洗涤沉淀；沉淀微干后加入500μlsste缓冲液[0.5％sds，1mmol/ledta(ph＝8.0)，1mol/lnacl，10mmol/ltris-cl(ph＝8.0)]溶解沉淀，加入等体积氯仿/异戊醇再抽提2次.

6)转移上清后加入0.25倍体积的异丙醇和0.25倍的rna沉淀剂，充分混匀后，于室温放置10min；4℃12000rpm离心10min收集沉淀，用70％乙醇漂洗两次，重复上述离心；用一次性使用的吸头吸尽残存的乙醇；将打开管盖的离心管放在实验台上几分钟，使残余的乙醇挥发掉，不要让rna干透；加50μldepc处理过的水，将rna溶液储存于-70℃。

针对植物总rna提取试剂(rnaplantplusreagent)法进行改良，分别用氯仿抽提一、二、三次，重复步骤5与6。由于红花檵木含有较高含量的花色素苷、多糖及次生代谢产物，适当增加氯仿抽提次数有利于提取杂质较少的红花檵木总rna。

1.3.2总rna样品琼脂糖凝胶电泳检测

用1×tae缓冲液(tris-乙酸-edta缓冲液，ph8.3)制备1.0％琼脂糖凝胶，按1：10000加入goldviewi型核酸染色剂，在点样板上混合5μlrna样品和lμl上样缓冲液溴酚蓝(tiangen)混合均匀后上样，电压120v，电流80ma，电泳时间30min。电泳完毕后，取出凝胶在凝胶成像系统中观察是否有rna条带，拍照并保存。

1.3.3总rna浓度及得率检测

取上述rna样品各2μl加入98μldepc水，混匀后用岛津uv-1800紫外分光光度计测定a230，a260，a280的值，重复3次，并计算a260/a230和a260/a280的比值，以检测rna纯度与浓度检测，并计算产率。

rna浓度(μg/ml)＝a260×40×稀释倍数

rna得率(μg/mg)＝(a260×40×稀释倍数×原液体积)/叶片鲜重(mg)

1.3.4氯仿抽提次数改良

针对植物总rna提取试剂(rnaplantplusreagent)法进行改良，分别用氯仿抽提一、二、三次，重复步骤5与6。由于红花檵木含有较高含量的花色素苷、多糖及次生代谢产物，适当增加氯仿抽提次数有利于提取杂质较少的红花檵木总rna。1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定a230，a260，a280的值，重复3次，并计算a260/a230和a260/a280的比值，以检测rna纯度与浓度检测，并计算产率。

1.3.5总rna样品特异性引物rt-pcr检测

(1)cdna第一链的合成

以提取的经上述检测高质量的总rna为模板进行反转录，合成cdna第一条链。pcr扩增的引物按花青素合成酶chs基因设计[19]，简并引物为chs52：5’-cctycgyatcacmaabagygagcac-3’；chs32：5’-caaayccraawagsacwccccac-3’；反转录的特异引物为b26(5’-gactctagacgacatcgattttttttttttttttt-3’)。所有引物均为invitrigen公司合成。

cdna第一链的反转录合成，反转录体系为25μl，先将5μlrna与2.5μlb26引物(2.5mmol/l)加入，再加入5×rtm-mlv缓冲液5μl、1μlmmlv-rt、5μldntp(10mmol/l)、0.13μlrna-inhibitor，然后用rnase-freeh2o加至25μl。在室温下放置10min，反应条件为42℃，1h，于冰上放置2min后，于-20℃保存。

(2)chs基因pcr扩增

以前面合成cdna第1链为模板，建立pcr反应体系和循环程序：在30μl的反应体系中分别加入3μlcdna第1链模板、4μl10×buffer(mg2+-plus)、5μldntp、1μltaq(2.5u/μl)、25pmol的正向引物和反向引物chs52、chs32个1μl，加15μlddh2o使总体积为30μl；pcr循环程序：94℃预变性4min；然后进行以下循环：94℃变性1min，35℃退火1min，72℃延伸1min，进行5个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，进行30个循环；然后72℃保温5min，取出待用。反应结束后，1.0％琼脂糖凝胶电泳分离观察，步骤参考1.3.2。

2下面结合具体分析对本发明作进一步描述。

2.1总rna样品琼脂糖凝胶电泳检测结果分析

琼脂糖凝胶电泳主要用来鉴定rna的完整性，是判断rna质量的一种重要手段。总rna样品的主要成分是28srrna，18srrna，5srrna。从电泳胶上28srrna和18srrna的完整性可以判断rna有无降解及降解程度，也可以判断有无dna和蛋白质污染。用9种方法提取红花檵木‘大叶红’和‘花叶1号’嫩叶叶片rna后，取5μlrna在1％的非变性琼脂糖凝胶上电泳，结果如图6。

从图6a可以看出，植物总rna提取试剂法提取的总rna质量较好，28srrna、18srrna带型明亮，完整性好，但5srrna上出现其他带型、28srrna与18srrna有拖尾现象，说明有少量的多糖残留，rna发生了微弱降解。从图6b可以看出，sds酚法提取的总rna质量一般，28srrna、18srrna与5srrna条带较弱，说明提取出rna的量较少，并且有dna的污染。从图6c、图6g、图6e可以看出，transzolplant试剂盒法、totalrnaisolationreagent试剂盒法与trizol法，电泳图上基本无rna带型，点样孔内有污染，证明蛋白质或多糖物质有残留，提取结果较差，几乎提取不出rna。从图6d可以看出，柱式植物rnaout法提取‘花叶一号’品种提取总rna亮度较弱，说明提取出rna量太少，‘大叶红’品种提取总rna亮度大，但18srrna有弥散现象，说明rna降解程度大。从图6f可以看出，plantrnakit试剂盒法基本提取不出总rna，泳道中背景颜色较深，说明杂质未去除，纯度较差，点样孔下方有杂质残留，且为出现清晰条带，说明蛋白质或多糖物质有残留，提取质量较差。从图6h可以看出，ctab法几乎提取不出‘花叶1号’品种总rna，泳道未见任何条带；‘大叶红’品种提取的总rna，5srrna明显，说明rna降解程度大，点样孔下方有明显的条带，说明有dna杂质。从图6i可以看出，改良的ctab法提取的总rna，点样孔下方有明显的条带，说明有dna杂质，条带弥散程度大，5srrna较宽，说明rna降解程度大。综上，从条带的亮度和完整性可以看出，植物总rna提取试剂法提取红花檵木总rna效果较好，sds酚法与柱式植物rnaout法提取的总rna效果一般，transzolplant试剂盒法、totalrnaisolationreagent试剂盒法、plantrnakit试剂盒法、trizol法、ctab法和改良ctab法提取总rna效果较差。

2.2总rna样品浓度及得率检测结果比较

紫外分光光度计主要用于检测rna的纯度。a230是杂质(多肽、苯酚、碳水化合物等)最高的吸收峰的吸收波长的吸光值；a260是核酸最高峰的吸收波长的吸光值，最佳测值范围应在0.1-1.0之间，若不在此范围内，应该稀释或浓缩样品；a280是蛋白质与酚类等有机物最高吸收峰的吸光值。不纯的样品一般不能用紫外吸收法做定量检测。通常纯净rna样品的a260/280的值应该在1.8-2.0之间，a260/280等于2.0为纯rna，a260/280等于1.8为纯dna，a260/280的值小于1.8时说明样品中存在蛋白质或酚类等其他有机物的污染，a260/280的值大于2.0时，说明rna样品的降解程度大。rna样品的a260/230的值应该大于2.0，若小于2.0,表明rna样品被碳水化合物、多肽、苯酚、糖类或有机溶剂污染，需要进行样品纯化。

对用9种方法各提取‘花叶1号’与‘大叶红’两个品种共18分样品进行了紫外分光光度计检测，测定a230，a260，a280的值，重复3次取平均值，并计算a260/a230和a260/a280的比值，计算rna的浓度与产率。结果如表1所示，其中有transzolplant试剂盒法、totalrnaisolationreagent试剂盒法、plantrnakit试剂盒法、trizol法以及ctab法提取未提取到rna，不能进行紫外分光光度计检测。在剩下的5种方法的9个样品中，植物总rna试剂提取法与柱式植物rnaout法的a260/280在1.8-2.0之间，表明这两种方法获得了较高纯度的rna；sds酚法与ctab法测定的a260/280值小于1.8，说明rna样品中有蛋白质或酚类等其他有机物质的污存在；改良ctab法测底的a260/280值大于2.0，说明rna降解程度大。rna样品的a260/230的值应该大于2.0，植物总rna试剂提取法、sds酚法与柱式植物rnaout法测定结果在正常范围之内，说明提取总rna的纯度较好，ctab法与改良ctab法测定的a260/230值小于2.0，说明样品被碳水化合物、盐类或有机溶剂污染，样品需要纯化。通常，可以通过分光光度计测定rna溶液260nm处的吸光值来计算rna的浓度，并计算得率。通过计算后，植物总rna试剂提取法提取到的总rna的浓度和得率最高，柱式植物rnaout法其次，sds酚法、ctab法与改良的ctab法提取出总rna的浓度和得率较低。

表1不同方法提取红花檵木总rna紫外吸光值测定结果

注“—”：未提取到rna

综上，植物总rna试剂提取法提取效果最好，提取到的总rna的浓度和得率高，a260/280与a260/230均在正常的范围内，总rna样品纯度好，柱式植物rnaout法次之，sds酚法、ctab法与改良的ctab法提取出总rna的浓度和得率较低，a260/280或a260/230超出正常的范围，含有蛋白质、酚类或碳水化合物等杂质，提取效果较差。

2.3植物总rna提取试剂法氯仿抽提次数对比结果分析

从2.1与2.2结果分析，植物总rna提取试剂法为红花檵木总rna提取较好的方法，但琼脂糖凝胶电泳结果5srrna上出现其他带型、28srrna与18srrna有拖尾现象，说明有少量的多糖残留，rna发生了微弱降解。针对植物总rna提取试剂法进行改良，分别用氯仿抽提一、二、三次，重复提取步骤5与6。由于红花檵木含有较高含量的花色素苷、多糖及次生代谢产物，适当增加氯仿抽提次数有利于提取到杂质较少的红花檵木总rna。

对红花檵木进行氯仿抽提次数对比试验，随着抽提次数的增加，离心产物也越来越澄清(见图7)，1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，并用紫外分光光度计测定a230，a260，a280的值，重复3次，并计算a260/a230和a260/a280的比值，以检测rna纯度与浓度检测，并计算产率。

用植物总rna提取试剂法分别用氯仿抽提一、二、三次，提取红花檵木‘大叶红’和‘花叶1号’嫩叶叶片rna后，取5μlrna在1％的非性凝胶上电泳，结果如图8。从图8a可以看出，植物总rna提取试剂法用氯仿抽提一次提取的总rna质量较好，28srrna、18srrna带型明亮，完整性好，但5srrna上出现其他带型、28srrna与18srrna有拖尾现象，28srrna与18srrna亮度相近，说明有少量的多糖残留，rna发生了微弱降解。从图8b可以看出氯仿抽提二次提取到的总rna，带型好，无弥散拖尾现象，rna完整性好，18srrna与28srrna的条带清晰，并且28srrna亮度是18srrna的2倍，没有降解的迹象，说明提取到的总rna完整性好质量高。从图8c可以看出，用氯仿抽提三次获得的总rna，带型清晰，亮度较暗，无弥散拖尾现象，但28srrna亮度与18srrna亮度相近，5srrna宽度大，说明获得的总rna的浓度降低，rna降解程度大。说明随着抽提次数的增加，多糖、蛋白质等杂质减少，提取到的总rna的浓度降低，rna降解程度变大，综合分析得到用氯仿抽提两次，获得的总rna纯度高质量好，为最佳抽提次数。

用植物总rna提取试剂法分别用氯仿抽提一、二、三次，提取红花檵木‘大叶红’和‘花叶1号’嫩叶叶片rna后，取上述rna样品各2μl加入98μldepc水，混匀，用紫外分光光度计测定a230，a260，a280的值，重复3次，并计算a260/a230和a260/a280的比值，以检测rna纯度与浓度检测，并计算产率，结果如表2所示。

表2不同抽提次数提取总rna紫外吸光值测定结果

用氯仿抽提一、二、三次提取到的总rna紫外吸收光值测定结果，‘花叶1号’品种与‘大叶红’品种数据差异不大。用氯仿抽提一次，总rna浓度与得率最高，a260/230值大于2.0，a260/280值在1.8-2.0的正常范围内，说明总rna提取质量较好。用氯仿抽提二次，总rna浓度和得率与抽提一次相比，稍有降低，a260/230值大于2.0，a260/280值在1.8-2.0的正常范围内，表明提取到的总rna质量好。用氯仿抽提三次，总rna浓度和得率大幅度下降，a260/230值正常，a260/280值大于2.0，说明rna降解程度大。说明随着抽提次数的增加，多糖、蛋白质等杂质减少，提取到的总rna的浓度和得率降低，rna降解程度变大。综合各因素分析，氯仿抽提两次提取的总rna纯度好，浓度与得率较大，a260/230值与a260/280值均在正常范围，为高质量的总rna，氯仿抽提二次为最适宜的抽提次数。

2.4总rna样品特异性引物rt-pcr检测结果分析

用植物总rna提取试剂法并用氯仿抽提两次提取‘花叶1号’和‘大叶红’两个品种的总rna，以总rna为模板进行反转录，合成cdna第一条链，以此第一链cdna为模板，以上述设计引物进行花青素合成酶chs基因的pcr扩增，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，以检测rna的质量，检测结果如图9所示。

以植物总rna提取试剂法提取两个品种的总rna为模板，通过rt-pcr分别获得一条清晰的大小为900bp的特异性条带，与所需目的chs基因片段大小一致，说明了反转录合成的cdna质量很好，进一步说明植物总rna提取试剂法提取的总rna具有较高的质量，可供分子生物学试验使用。

3下面结合结果对本发明作进一步描述。

本试验采取9中方法提取红花檵木‘花叶1号’与‘大叶红’品种总rna，其中植物总rna提取试剂法最优并对其改进，用氯仿抽提两次，提取的总rna，电泳条带清晰、明亮，没有拖尾现象，28srrna亮度是18srrna的2倍，没有降解的迹象，点样孔内未出现明显亮斑，点样孔下方未有明显的条带，而且1.95<a260/280<2.0，a260/230>2.0，浓度和得率高，表明这种方法提取的总rna完整性好、纯度高，成功的出去了多糖、花青素、多酚等次生代谢产物和小分子杂质。此方法提取过程简单、方便、迅速，在1个小时内可以完成。并以植物总rna提取试剂法提取两个品种的总rna进行rt-pcr检测，分别获得一条清晰的大小为900bp的特异性条带，与所需目的chs基因片段大小一致，说明了反转录合成的cdna质量很好，进一步说明植物总rna提取试剂法提取的总rna具有较高的质量，可供分子生物学试验使用。说明植物总rna提取试剂法最适合红花檵木总rna提取的方法，该方法提取的总rna完整性好，无降解，浓度大，重复性好，提取简单方便快捷，可供分子生物学试验用，也为其它多糖多色素植物总rna提取提供参考。

其他8中方法中，transzolplant试剂盒法、totalrnaisolationreagent试剂盒法、plantrnakit试剂盒法、trizol法以及ctab法提取‘花叶1号’品种未提取到rna，电泳无明显条带，不能进行紫外分光光度计检测。另外5中方法提取的总rna电泳图均出现了条带不清晰、拖尾、弥散、点样孔有亮斑、点样孔下有明显条带等现象，a260/280<1.8或a260/280>2.0，，a260/230<2.0，说明这些方法提取到的红花檵木总rna有多糖、蛋白质、dna、多酚、碳水化合物等杂质，rna发生了降解，浓度和得率较低，rna的质量较差。说明这些方法不适用于红花檵木总rna的提取，不能得到高质量的总rna。

影响总rna提取质量的因素是多方面的，如组织的破碎程度、rnase的活性、提取材料的生长状态、多酚、多糖、蛋白质与dna等大分子物质的存在。

样品在提取总rna前应当进行充分的研磨，离心管应该预先用液氮遇冷并装好液氮，将叶片灭菌刀片切割成小片(重量约为25-30mg)，液氮浸泡离心管内叶片约10s后小杵快速研磨成粉状，要保证充分研磨。加入提取液后应该充分涡旋振荡，使样品彻底裂解，提高rna收率，并且能打断基因组中的dna。

预防rnase污染，应注意以下几点。经常更换新手套，带好口罩，尽量减少交谈和人员流动。实验所需器皿、耗材用depc水处理之后再高温灭菌，防止外源rnase污染，使用灭菌过的塑料制品和枪头避免交叉污染。配制溶液应使用无rnase的水，如配制75％乙醇。整个研磨过程必须在液氮浸泡中进行，避免由于液氮冷冻不足而导致温度回升以致内源rnase对rna降解和多酚氧化，以及研磨期间再次加液氮引起粉末飞溅致使样品损失和交叉污染的后果。预先称量估计后直接剪取，可避免由于样品称量在研磨所导致的褐变。

选择合适的生长状态红花檵木提取材料，对总rna提取十分关键。由于rna是dna经过转录后形成的，rna与dna在空间上是分离的，rna在细胞质中，dna在细胞核内，而且rna的半衰期一般都很短，几乎在表达后就会自动降解。由于生物在幼嫩的植株或生长旺盛的生命体中需要大量合成所需的物质以满足生长,rna是合成这些物质的模版，所以这段时期rna的含量会异常的多。由此在提取红花檵木总rna时，要选择生长性状良好,较幼嫩的植株叶片,提高提取高纯度、高质量rna的几率。不应该选择生长状态较差，衰老、生病、腐烂的植株，这些植株不良刺激代谢产物增多，影响到总rna提取的结果。

多酚和色素等次生代谢产物是rna提取的一个棘手的问题，红花檵木含有大量的此生代谢产物，酚类化合物使rna提取过程极易氧化[7]。植物材料经过前期的破碎处理之后，酚类物质会释放出来，氧化后处理液变为褐色，并随着氧化程度而加深。被氧化的酚类化合物能与rna不可逆地结合，导致rna活性丧失而沉淀。为解决酚类氧化问题，可以用β-巯基乙醇作为还原剂，植物总rna提取试剂法中提取液中加入了20％的β-巯基乙醇，防止酚类物质氧化。

多糖物质严重影响了rna提取的质量和产率，红花檵木含有大量的多糖类物质，有效的除去多糖类物质是成功提取高质量rna的关键[7]。多糖的许多理化性质与rna很相似，很难将他们分开，在去除多糖的同时rna也被裹携走了，造成rna产量的较少；而在沉淀rna是，也产生了多糖的胶状沉淀，这种含有多糖的rna沉淀很难溶于水，或者溶解后产生粘稠状的溶液。针对红花檵木叶片中色素含量高，抽提过程中多糖、色素残留严重的问题，用氯仿抽提2次，抽提后rna几乎无多糖和色素的残留，从而可以有效的去除rna中的色素和多糖。抽提过程用氯仿而不用苯酚，既可以出去蛋白质，有可以防止苯酚对rna的破坏。在rna提取过程中还存在一定的dna污染，因而应用这些样品进行rt-pcr或其他操作前应先用dnase降解dna，经dnase消化后的rna用于rt-pcr时将不再产生干扰。

综上所述，以红花檵木‘花叶1号’和‘大叶红’品种组培苗叶片为试验材料，利用植物总rna试剂提取法、trizol法、sds酚法等9种方法提取总rna。结果表明：transzolplant试剂盒法、totalrnaisolationreagent试剂盒法、plantrnakit试剂盒法、trizol法以及ctab法均未提取到rna。sds酚法、柱式植物rnaout法以及改良ctab法提取物种含有多糖、多酚等杂质，提取的rna质量少，不足以后续的研究。利用植物总rna试剂法并对其进行改良，此方法所得rna完整性好，纯度和浓度均较高，可用于rt-pcr分析研究及后续试验。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

技术特征：

技术总结
本发明属于植物组织RNA提取技术领域，公开了一种红花檵木叶片总RNA的提取方法，准备红花檵木叶片，灭菌刀片切割成小片放入灭过菌的离心管，液氮浸泡研磨成粉状；加入植物总RNA提取试剂；上清转入新的无RNase离心管；加入NaCl、氯仿，上下颠倒混匀；取上层水相转入新的无RNase离心管；加与所得水相等体积的异丙醇，混匀，室温放置；弃掉上清，加乙醇；倒出液体，剩余的液体离心，然后用枪头吸出，室温晾干；加DEPC水，溶解RNA；在RNA中加入buffer RDD，DNase储存液，孵育；加EDTA，孵育；将RNA于‑70℃保存。本发明提取的红花檵木总RNA纯度高，杂质少。

技术研发人员：张力;于晓英;彭诗怡;李炎林;李达;冯岳东;符红艳
受保护的技术使用者：湖南农业大学
技术研发日：2019.03.15
技术公布日：2019.05.14