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skti和p

来源：花匠小妙招时间：2024-11-13 04:10

【摘要】： 目前洋桔梗是国际市场上最流行的鲜切花之一,但由于生产发展迅速,栽培面积不断扩大,进出口及国内贸易频繁,导致其在生产过程中遭受各种害虫的危害,严重影响了切花质量以及种植业稳步发展。植物抗虫基因工程的诞生为害虫的防治提供了一条崭新的途径。然而,研究焦点主要集中在经济农作物上,花卉抗虫基因工程虽然有一定发展,但是还处于初级阶段,而且关于洋桔梗抗虫基因工程的研究几乎还未见报道。因此,对洋桔梗抗虫基因工程的研究,不仅可以解决洋桔梗生产过程中的虫害问题,为洋桔梗种植业的进一步发展奠定基础,而且还可以拓宽洋桔梗的种质资源。大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(SKTI)对鳞翅目害虫的蛋白酶活性具有很强的抑制作用。本研究为了在洋桔梗中过量表达SKTI以针对危害其根部的磷翅目类害虫,构建了skti组成型的植物表达载体。首先,设计了两条特异性的引物来扩增skti的编码区。然后,通过RT-PCR从大豆总RNA中扩增出skti的cDNA并亚克隆到载体pMD18-T中得到pMD18-skti。随后,将skti从skti切下并连接到改进过的载体pENTR*-as(周雨隆,硕士论文)的SalⅠ和BamHⅠ之间得到入门载体pENTR*-skti。最后,通过LR反应将pENTR*-skti中的skti片段重组到含有35S启动子的植物表达载体pK2GW7中,得到组成型植物表达载体pK2-35S-skti。豌豆外源凝集素(P-Lec)对人畜的毒性极低,其转基因植物对同翅目和鞘翅目昆虫有明显的抗性。本研究为了在洋桔梗中过量表达P-Lec以针对危害其绿色幼嫩组织的同翅目和鞘翅目类害虫,构建了p-lec光诱导植物表达载体。首先,设计了两条特异性的引物来扩增p-lec的编码区。然后,通过PCR从豌豆基因组DNA中扩增出p-lec编码区并亚克隆到pMD18-T中得到pMD18-p-lec。为了使该基因在组织-特异表达启动子(PrbcS)控制下,在转基因植物的绿色幼嫩组织中大量表达P-Lec,将p-lec从pMD18-p-lec上切下并连接到含有番茄Rubisco小亚基rbcs-3c光诱导启动子(PrbcS)的改造过的载体pENTR*-PrbcS-adh(宋中邦,硕士论文)的SphⅠ和EcoRⅠ之间得到pENTR*-PrbcS-p-lec。最后,通过LR反应将pENTR*-PrbcS-p-lec中的PrbcS-p-lec片段重组到植物表达载体pK2GW7中,得到光诱导植物表达载体pH2-35S-PrbcS-p-lec。通过农杆菌介导法用pK2-35S-skti和pH2-35S-PrbcS-p-lec转化洋桔梗(Prairiegentian and Polestar yellow)。为了优化洋桔梗的转化条件,研究了其再生系统和抗生素敏感性。结果显示,Prairie gentian最佳再生培养基为MS+6-BA0.5(mg/L)+IBA0.2(mg/L); Prairie gentian and Polestar yellow能够耐受的最高卡那霉素和潮霉素浓度分别为30mg/L和15mg/L；适合抑制农杆菌生长的最高头孢噻肟钠浓度为150mg/L;最佳转化条件是转染前预培养两天,转染的过程中加入乙酰丁香酮(25mg/L),浸染20min,转然后共培养3天。在含有抗生素的培养基上筛选转基因植物,并通过PCR验证。分别获得2个整合了pK2-35S-skti的转基因株系,12个整合了pH2-35S-PrbcS-p-lec的转基因株系。转基因植物中skti和p-lec表达水平的检测以及幼虫喂养化验将在以后的研究工作中进一步完成。

【学位授予单位】：昆明理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2009

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