核盘菌SsBMR1基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用的制作方法

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及核盘菌ssbmr1基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用。

背景技术：

由核盘菌(sclerotiniasclerotiorum(lib.)debary)导致的菌核病不仅是模式植物拟南芥的一种病害，也是危害我国很多重要农作物生产的重要病害之一，比如该病害每年导致油菜10～30％的产量损失，严重时减产80％(吴健等2013)，并且导致种子含油量和品质降低。

核盘菌主要以菌核的形式生存，菌核的抗逆性极强，可在土壤中存活多年。在核盘菌的侵染过程中，菌核可以直接萌发成菌丝，侵染植物；或者是通过萌发子囊盘，产生子囊孢子萌发形成菌丝，从而侵染植物。菌丝在入侵到植物组织前，首先在寄主表面扩展，形成侵染垫或附着胞，渗透健康的植物表皮，而菌丝则产生更多的分枝(amselem，2011；liangandrollins，2018)。随后，核盘菌通过合成、分泌多种水解酶及毒素草酸攻破寄主表层防护、降解细胞壁、浸软和致死寄主组织，为病菌提供营养，便于菌丝进一步入侵和增殖(bashietal.2012；kimetal.2008；seifbarghietal.2017)。因此，如果核盘菌菌核或菌丝生长形成受阻，菌核病可以有效控制。

目前，防治油菜抗菌核病主要有如下途径：农药与生物防治、选育抗(耐)菌核病材料、基因工程方法。通过这些途径，取得了一些成绩，筛选到一些抗(耐)病性比较好的材料，但是生产中菌核病危害严重的问题依然存在(刘正立,刘春林.甘蓝型油菜抗菌核病研究进展.中国农学通报,2015,31(15):114-123)。

专利文献cn106397555a和cn106518992a分别公开了核盘菌凝集素ssl-6蛋白和核盘菌异核体不亲和yd-7蛋白，通过构建蛋白编码基因的过表达质粒，并转入宿主植物中，获得具有抗菌核病的植物种质资源。

技术实现要素：

为减少核盘菌对植株侵害，本发明提供一种影响核盘菌菌丝生长和侵染垫形成的核盘菌ssbmr1基因，该基因的部分编码序列的正义序列和反义序列分别与沉默载体pcit的内含子的两端连接形成ssbmr1的rnai结构，将该rnai结构接入植物表达载体得到寄主诱导表达沉默载体，该寄主诱导表达载体转染宿主后，能够产生靶向ssbmr1基因的dsrna片段，从而在核盘菌侵染过程中诱发ssbmr1基因的沉默，显著增加宿主的核盘菌抗性。

核盘菌ssbmr1基因，其编码氨基酸序列如seqidno.1所示的蛋白；

优选的，所述核盘菌ssbmr1基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

上述核盘菌ssbmr1基因在构建沉默ssbmr1基因的寄主诱导表达沉默载体中应用也属于本发明的保护范围。

本发明还提供了沉默ssbmr1基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，该方法包括以下步骤：克隆ssbmr1基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别与seqidno.3所示核苷酸序列的两端相连得到ssbmr1基因的rnai(rna干扰，rnainterference)结构，将所述rnai结构接入植物表达载体的启动子和终止子之间得到所述寄主诱导沉默表达载体。

上述ssbmr1基因的部分编码序列，是ssbmr1基因的保守序列的一段核苷酸序列，长度为300-500bp之间，所述正义和反义序列分别连接到内含子两端，在植物中转录后形成发卡结构，产生ssbmr1基因的dsrna片段，该dsrna被识别后即被核酸内切酶(rnaseⅲ)切割成长度为21～35个核苷酸的rna片段(sirna)。双链sirna在rna解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义sirna再与体内一些酶(包括内切酶、外切酶、螺旋酶)或蛋白结合，形成rna诱导沉默复合体(rna-inducedsilencingcomplex,risc)。在atp存在的情况下，被激活的risc以单链sirna作为向导，通过碱基互补配对原则，以序列特异性的方式引导argonaute蛋白与靶标分子结合去寻找与之互补的靶基因ssbmr1。ssbmr1的mrna分子被argonaute蛋白识别之后会被切割或者抑制翻译，最终被细胞降解。

优选的，所述沉默ssbmr1基因的寄主诱导沉默表达载体的构建方法，包括以下具体步骤：

(1)克隆ssbmr1基因的部分编码序列，将其正义序列和反义序列分别连入载体pcit的内含子两端，构建沉默表达载体p-rnai-hyg，所述正义序列、pcit的内含子(seqidno.3)和反义序列连接形成的核苷酸片段为ssbmr1基因的rnai结构；

(2)酶切沉默表达载体中的rnai结构，将其连入植物表达载体的启动子和终止子之间，得到所述寄主诱导沉默表达载体r-higs。

上述载体pcit(yuetal.2012,plosone,7,e34962)，包含来源于aspergillusnidulans的trpc基因的启动子ptrpc及终止子ttrpc，以及来源于gibberellazeae的eaa75655.1基因的402bp的内含子片段(seqidno.3)。

优选的，所述沉默表达载体p-rnai-hyg中含有潮霉素(hyg)和氨苄青霉素(amp)抗性元件。其中筛选标记潮霉素(hyg)可以用遗传霉素(g418)代替。

优选的，所述植物表达载体为pbinglyred3，其含有种子特异型的glycinin启动子和gly-term终止子的载体，所述glycinin启动子可以用camv35s启动子代替，gly-term终止子可以用nos终止子代替。所述植物表达载体的具体结构参见(“叶绿素合成酶基因在甘蓝型油菜及拟南芥种子生育酚合成过程中的作用研究，周元委，2017，硕士学位论文)”。

优选的，所述ssbmr1基因的rnai结构通过多克隆位点插入所述glycinin启动子和所述gly-term终止子之间，所述多克隆位点具体为ecori、xbai、xmai、smai和xhoi。

优选的，所述植物表达中还含有卡那霉素(kana)抗性元件，同时包含一个红色荧光蛋白(dsred)的筛选标记，dsred的启动子为cmv启动子，终止子为nos终止子。所述红色荧光蛋白筛选标记可以由潮霉素(hyg)抗性元件代替。

上述构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，经浸花法(flowerdip)转化拟南芥，菌核病抗性鉴定表明，活体接种的转基因拟南芥的菌斑面积相比对照显著减小。

因此，上述构建方法构建的寄主诱导沉默载体属于本发明的保护范围。

上述构建方法制备的寄主诱导沉默表达载体和上述核盘菌ssbmr1基因在植物菌核病抗性育种中的应用也属于本发明的保护范围。

优选的，所述植物菌核病抗性育种是指十字花科植物菌核病抗性育种。

本发明还提供上述寄主诱导沉默表达载体在植物菌核病抗性育种中的应用方法，采用寄主诱导沉默表达载体转化农杆菌，农杆菌浸花法转化植物的花序得转化后的花序，将植物培养至种子成熟，利用基因标记挑选转化成功的植株。

本发明的有益效果在于：

1.本发明提供了发明提供了核盘菌ssbmr1基因的基因组及蛋白序列，该基因影响核菌丝生长，菌核以及侵染垫的形成，在核盘菌耐药以及致病方面具有重要作用；

2.本发明的构建方法构建的寄主诱导沉默表达载体，将其转化十字花科植物后，t0代收获的种子长成的植株(t1代)具有菌核病抗性，且可被遗传至后代，其在十字花科植物菌核病抗性育种具有巨大的应用前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步的详细描述，其中：

图1为分别1980生长3d，4d，5d后rna电泳结果。

图2为sstub引物检测1980生长3d，4d，5d的cdna电泳结果。

图3为ssbmr1基因特异干扰片段与higs沉默片段扩增结果

图4为沉默片段t克隆菌液pcr检测结果，图a为t-rnai菌检结果，图b为t-higs菌检结果。

图5为沉默表达载体构建图，a为中间载体p-rnai-he及p-higs-he菌检结果，b为载体p-rnai及p-higs菌检结果。

图6为p-rnai-hyg菌检结果。

图7为xbai单酶切检测p-rnai-hyg质粒结果。

图8为ssbmr1基因的higs载体构建图，a为r-higs菌检结果，b为xbai/xhoi双酶切检测r-higs质粒结果。

图9为r-higs质粒转化农杆菌pcr检测结果。

图10为利用潮霉素抗性基因对ssbmr1基因沉默转化子进行dna鉴定结果。

图11为rt-pcr鉴定沉默转化子中ssbmr1基因的表达水平。

图12为ssbmr1基因沉默转化子bmr1-1及bmr1-26菌丝生长速度测定。

图13为ssbmr1基因与侵染垫形成相关est标签dv643729比对结果。

图14为ssbmr1沉默转化子在parafilm上的侵染垫形成情况。

图15为ssbmr1沉默转化子菌核形成情况，a为沉默转化子bmr1-1及bmr1-26生长25d后菌核产生的数量，b为沉默转化子bmr1-1及bmr1-26生长25d后产生菌核的质量。

图16为ssbmr1沉默转化子bmr1-1、bmr1-14及bmr1-26对油菜茎秆致病性鉴定。

图17为ssbmr1沉默转化子bmr1-1、bmr1-26及bmr1-32对油菜叶片致病性鉴定。

图18为ssbmr1沉默转化子bmr1-1、bmr1-26对拟南芥叶片致病性鉴定。

图19为ssbmr1沉默转化子耐药性观察。

图20为higs转基因拟南芥dna检测结果。

图21为higs转基因拟南芥的菌核病抗性鉴定结果。

具体实施方式

下面将结合本发明具体的实施例，对本发明技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规步骤，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的步骤，或按照试剂盒制造厂商所建议的操作步骤。

实施例采用的植物材料：拟南芥为哥伦比亚生态型野生型col-0，甘蓝型油菜为中双11号。甘蓝型油菜为常规大田试验条件种植，拟南芥为培养箱常规培养。

实施例采用的菌株：核盘菌野生型菌株1980，核盘菌沉默表达载体pcit，植物表达载体pbinglyred3由重庆市油菜工程技术研究中心提供。dh5α大肠杆菌和gv3101根瘤农杆菌均购自全式金生物公司。

实施例采用的试剂及相关试剂盒：酵母提取物、胰蛋白胨、氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、利福平(rifampicin)等相关试剂均购于北京鼎国昌盛有限公司。t4dna连接酶、限制性内切酶均购于赛默飞公司(thermofisherscientific)。pcr试剂、dnamarker、dna回收试剂盒、质粒dna提取试剂盒及rna提取试剂reagent-a+总均购于北京天根有限公司。cdna合成试剂盒iscripttmcdnasynthesiskit、rt-pcr的itaqtmuniversalgreensupermix购自biorad公司。蔗糖、peg4000、潮霉素、表面活性剂silwet-l77、琼脂糖、多菌灵、啶酰菌胺等。

实施例采用的相关试剂配制：

ctabbuffer(1l)：ctab20g，nacl81.88g，edta(0.5m，ph8.0)40ml，tris-hcl(1m，ph8.0)100ml，121℃灭菌20min。

原生质体缓冲液：称取39.47gmgso4·7h2o，加蒸馏水溶解定容至200ml，调节ph＝5.5，121℃灭菌20min后冷却保存。

原生质体酶解液：分别称取裂解酶0.2g，蜗牛酶0.02g，用原生质体缓冲液液溶解定容至20ml，抽滤灭菌，一般现配现用。

peg(40％w/v)：称取40gpeg4000，完全溶解于蒸馏水中并定容至100ml，121℃、灭菌20min后冷却保存。

stc：分别称取d-山梨醇29.15g，tris1.2114g，cacl22.191g，用蒸馏水定容至200ml，121℃灭菌20min后冷却保存。

ptc(40％w/v)：40gpeg4000溶解于用上述stc溶液溶解并定容至100ml，调ph＝8.0，121℃灭菌20min后冷却保存。

edwardsbuffer：分别称取sds0.5g，edta9.306g，nacl14.61g，200mltris-hcl(ph＝7.5)蒸馏水，定容至1l。

mes重悬液(10nmol/l，ph＝5.6)：分别称取mes0.190g，mgcl2·6h2o0.407g，加蒸馏水定容至200ml，高温灭菌，冷却后加入0.1％as。

抗生素：氨苄青霉素(amp)100mg/ml、卡那霉素(kana)100mg/ml、链霉素(str)25mg/ml。

主要培养基：

lb培养基(1l)：胰蛋白胨(tryptone)10g；酵母粉(yeastextract)5g；氯化钠(nacl)10g，ph＝6.8，121℃灭菌20min，lb固体培养基在此基础上，加琼脂粉10g。

yeb液体培养基(1l)：牛肉浸膏(beefextract)5g，酵母粉(yeastextract)1g，胰蛋白胨(tryptone)10g，蔗糖(sucrose)5g，一水硫酸镁mgso4·h2o0.5g，ph＝6.8，121℃灭菌20min。yeb固体培养基在此基础上，加琼脂粉10g。

pda：称取200g土豆，去皮后洗干净并切成小块，置于800ml蒸馏水中文火煮30min后用纱布过滤至1l三角瓶中，加入20g蔗糖，18.00g琼脂粉混匀，并用蒸馏水定容至1l，121℃灭菌20min待用。pdb不加琼脂粉即可

顶部培养基：称取342.3g蔗糖，0.5g酵母提取物，0.5g酪蛋白水解物，12g琼脂粉，定容至1l，121℃高温灭菌20min后待用。

底部培养基：称取239.6g蔗糖，0.5g酵母提取物，0.5g酪蛋白水解物，16g琼脂粉，定容至1l，121℃高温灭菌20min后待用。

实施例中所用的引物信息：

实施例1总rna的提取及cdna第一链的合成

收集核盘菌1980生长5d的菌丝提取rna，具体操作步骤参照天根公司trnzol提取试剂提取说明书；并进行琼脂糖凝胶电泳后放入凝胶成像系统进行观察和拍照；采用紫外可见分光光度计，取1μlrna测浓度，并以此为基础扩增目的片段，检测rna提取结果(图1)，片段清晰，将rna反转成cdna链后可用于后续实验的操作。

选用bio-rad公司反转录试剂盒，反应体系如下：

注：rnatemplate加入的总量为1μg左右，加完样后混匀，在pcr仪中进入反应程序。

反应程序为：priming25℃5min；reversetranscription46℃20min；rtinactivation95℃1min；optionalstep4℃。获得的cdna-20℃保存。

将rna反转成cdna链后，用sstub检测cdna质量(图2)，片段清晰，可用于后续实验的操作。

实施例2ssbmr1基因特异干扰片段的克隆

2.1ssbmr1特异片段扩增

以实施例1获得的cdna为模板，分别使用引物组合ssbmr1rnaif/ssbmr1rnair、ssbmr1higspf/ssbmr1rnair扩增目的干扰片段。pcr反应体系如下：

pcr反应程序：(1)预变性94℃5min；(2)变性94℃25s；(3)退火57℃25s；(4)延伸72℃55s；(5)再延伸72℃5min；(6)停止16℃1min；其中(2)-(4)循环35次。

目的基因进行pcr扩增后，对目的片段进行胶回收，具体操作步骤参照天根胶回收试剂盒说明书。扩增结果如图3，两组引物均在±376bp有明显条带，扩增出ssbmr1基因特异沉默片段，分别记为rnai和higs。

2.2连接t载体

将上述2.1中胶回收的干扰片段与easyvector于4℃连接过夜，并将胶回收产物转化至大肠杆菌感受态细胞，具体转化步骤参照天根公司提供的使用说明书。当目的基因转入到t-克隆载体后，选用引物组合为m13r+m13f对挑选的12个单克隆进行pcr鉴定，琼脂糖凝胶电泳如图4，若其在±376bp有明显条带，则为阳性克隆，相反，则为假阳性。结果显示，用于核盘菌体内干扰载体的阳性克隆有8个记为t-rnai，用于植物寄主诱导基因沉默干扰载体的阳性克隆有3个记为t-higs，分别各挑取两个单克隆菌液送公司进行测序，选取测序结果正确的阳性克隆子进行后续操作，其中，rnai的具体序列如seqidno.4所示，higs的具体序列如seqidno.5所示，其中，seqidno.4分别在ssbmr1基因的376bp干扰片段的序列(seqidno.6)的基础上，在左右两端分别引入酶切位点及保护碱基序列(5’-3’)：tcccccgggaagctt及gatatcctgcagttt(斜体的序列为酶切位点序列，非斜体序列为保护碱基序列)。seqidno.5分别在ssbmr1基因的376bp干扰片段的序列(seqidno.6)的基础上，在左右两端分别引入酶切位点及保护碱基序列：cccaagctttctaga及gatatcctgcagttt。

实施例3沉默载体的构建

3.1质粒的提取

分别提取测序正确含目的基因的t载体质粒和表达载体pcit、pbinglyred3的质粒，具体步骤参照天根质粒提取试剂盒说明书。

3.2目的片段与载体的双酶切

双酶切体系：

上述酶切体系在37℃培养箱中酶切2h。

3.3干扰表达载体的构建

连接t载之后提取含目的基因的质粒及pcit质粒通过hindiii/ecorv双酶切的方法将干扰片段以正向方式连接到pcit上构建成功的载体作为中间载体分别记为p-rnai-he和p-higs-he，使用引物组合ssbmr1rnaif+ssbmr1rnair及ssbmr1higspf+ssbmr1rnair进行菌液pcr检测，挑选12个单克隆进行阳性鉴定，条带大小约为±376bp则为阳性，相反，则为假阳性，如图5a。结果显示，12个克隆子均显示为阳性，中间载体构建成功。

通过smai/psti双酶切的方式将干扰片段以反向方式分别连接到中间载体p-rnai-he和p-higs-he上，使用引物组合pif/pir进行菌液pcr检测。

通过菌液pcr检测，片段大小约为±1200bp为阳性克隆，否则为假阳性，构建成功的载体分别记为p-rnai和p-higs，如图5b。结果显示，p-rnai有11个阳性单克隆，p-higs有8个阳性单克隆，可用于后续研究。

3.4干扰载体连接潮霉素基因

将上述检测正确的p-rnai材料提取质粒并用限制性内切酶xbai进行单酶切后将潮霉素基因连接到p-rnai载体上。单酶切体系如下：

将潮霉素基因连接到p-rnai表达载体上获得最终的ssbmr1基因的rnai载体，记为p-rnai-hyg，用引物组合sshygf+sshygr进行鉴定如图6，若其条带大小为±874bp则为阳性克隆，相反，则为假阳性。结果显示，共有6个阳性克隆子。选用1号阳性克隆子提取质粒用xbai进行单酶切验证(图7)，条带大小为±2000bp左右，检测结果正确，可用于后续实验。

3.5higs载体构建

通过xbai单酶切p-higs质粒，回收酶切下来的±2000bp左右片段，通过xhoi再次单酶切，回收1200bp左右的片段即为干扰主体结构片段，并将该片段构建到经xbai/xhoi双酶切的植物表达载体pbinglyred3上获得ssbmr1基因的higs载体，记为r-higs。使用引物组合qw586f/ssbmr1higsrr进行菌液pcr检测，如图8a，片段大小约为±400bp，即为阳性克隆，相反，则为假阳性。结果显示，挑取的10个单克隆子条带大小均正确。提取条带正确的单克隆质粒，用xbai/xhoi双酶切检测，条带大小约±1200bp，如图8b，结果显示酶切条带大小正确，用于拟南芥转化的干扰载体构建成功，可用于后续研究。

3.6农杆菌转化

将上述3.5中验证正确的植物沉默表达载体质粒转化农杆菌用于侵染植物，具体步骤参照博迈德公司gv3101农杆菌感受态转化说明书。用引物组合qw586f+ssbmr1rnair对挑选的农杆菌单克隆进行检测(图9)，条带大小约为±400bp为阳性克隆子，否则为假阳性。结果显示，挑选的12个单克隆均为阳性单克隆。

实施例4ssbmr1沉默转化子的筛选

4.1核盘菌原生质体的制备

(1)于超净工作台上，挑取新鲜核盘菌菌丝于研钵中研磨后转入含pdb培养基的三角瓶中，混匀，20℃摇床震荡培养32h；

(2)培养好的菌丝液体4000rpm，4℃，离心10min，去上清，底部菌体用0.8mmgso4洗涤两次；

(3)将菌丝球挑出至新的三角瓶中，加入酶解液混匀，于30℃摇床中酶解2-3h,期间抽取1ml酶解液在计数板上观察酶解情况；

(4)用灭过菌的漏斗过滤酶解后的溶液，滤液即为核盘菌原生质体溶液；

(5)将上述溶液用0.8mmgso4溶液清洗两次，3000rpm，4℃离心10min，弃上清液，沉淀即为核盘菌的原生质体；

(6)用悬浮液稀释原生质体沉淀；

1ml悬浮液：stc800μl，dsmo10μl，肝素钠60μl，peg(40％w/v)200μl，最后分装为每管100μl；

(7)原生质体保存在-80℃低温冰箱中，待用。

4.2peg介导的原生质体转化

将构建好的基因沉默载体质粒p-rnai-hyg单酶切线性化后利用peg介导的原生质体转化的方式转化核盘菌1980，具体步骤如下：

(1)将质粒单酶切线性化后胶回收，加入2μl亚精胺和2μl肝素钠；

(2)将上述胶回收产物加入100μl原生质体中，冰浴40min；

(3)向上述预混液中加入1mlptc，轻揉混匀，切勿吹打震荡，室温放置30min；

(4)将上述溶液加入55℃左右的rm底部培养基中，混匀，迅速倒在培养皿中，每皿约20ml左右，于22℃培养箱中倒置培养；

(5)培养24h后，向底部培养基表面倒入5ml含潮霉素50μg/l的rm顶部培养基；

(6)在22℃培养箱中倒置培养约5-7d，在顶部培养基表面重新长出的单菌落。

4.3重组转化子的筛选和鉴定

通过含潮霉素(100μg/ml)抗性的pda培养基筛选重组转化子，共筛选3次，最终获得具有稳定潮霉素抗性的转化子菌落。并收集菌丝，采用ctab法提取核盘菌重组转化子dna，以筛选的转化子dna为模板，用潮霉素基因引物sshygf/sshygr进行pcr扩增，以验证转化子dna，

ctab法提取dna步骤如下：

(1)将核盘菌菌丝研磨成粉末于2mlep管中；

(2)加入1ml提前于65℃预热的ctab缓冲液中，65℃水浴5min，期间轻柔混匀2次；

(3)加入苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)液1ml并混匀，12000rpm离心10min；

(4)吸取上清，加入等体积的氯仿：异戊醇(24：1)混液并混匀，12000rpm离心10min；

(5)吸取上清液，加入等体积的提前-20℃预冷的异丙醇，混合均匀，室温静置30min，12000rpm离心10min；

(6)去掉上清液，沉淀用70％的乙醇洗涤2次，与37℃温箱晾干，待晾干后，加入30μlte，吹打混匀，于37℃溶解30min后，保存于-20℃待用。

通过对转化子dna鉴定，使用引物sshygf+sshygr进行鉴定，若其条带大小约为874bp则为阳性转化子，相反，则为假阳性。结果显示，条带正确的阳性转化子有6个(图10)。提取阳性转化子rna，反转录合成cdna，根据ssbmr1基因组序列设计定量引物，以cdna为模板，以核盘菌持家基因sstubulin作为内参基因进行实时荧光定量pcr分析转化子中基因相对1980的表达水平。

荧光定量pcr反应体系：

荧光定量pcr反应条件：

94℃，2min；94℃，15s；60℃，30s，+plantread；3.goto2，44moretimes；meltcurve65℃to95℃，increase0.5℃；for0:05+platereadend

以转化子cdna为模板通过qrt-pcr鉴定野生核盘菌1980以及不同ssbmr1基因转化子的表达情况。结果显示，筛选到6个转化子，ssbmr1基因表达量均低于1980(图11)，为有效沉默转化子。

实施例5ssbmr1基因沉默转化子表型鉴定

5.1ssbmr1基因沉默转化子的生长速度

将上述筛选得到有效转化子随机选取2个转化子与野生菌株1980，分别培养在pda培养基上，每个转化子3皿，实验重复3次，分别在生长12h，24h，36h后采用十字交叉法测量菌丝生长面积(图12)。结果显示，与1980相比，12h时转化子菌丝平均生长面积减少约25％，24h减少约19％，36h减少约21％；菌丝生长速度表现为先升高再降低的趋势，在12-24h这一阶段菌丝生长最快，但沉默转化子的生长速度仍显著低于野生型1980菌株，表明ssbmr1基因可通过影响核盘菌菌丝的生长速度从而影响菌丝的蔓延扩散，干扰ssbmr1基因的表达可影响核盘菌菌丝生长速度，导致核盘菌生长缓慢，菌丝生长面积显著减小。

5.2ssbmr1沉默转化子的侵染垫观察

将ssbmr1基因序列比对到核盘菌侵染垫的est数据库。结果显示，est标签dv643729与ssbmr1除1个碱基的差异外dv643729的碱基序列能够完全比对到ssbmr1基因的序列上(图13)，表明ssbmr1可能与核盘菌侵染过程中侵染垫的发生有关；另外，将在pda培养基上正常生长两代的转化子及1980，从菌丝边缘部分打孔接种到铺有玻璃纸的pda培养基上生长，在生长3h，6h，9h后取出玻璃纸用台盼蓝染色3h后，在体式显微镜下对侵染垫进行观察(图14)。结果显示ssbmr1基因沉默转化子形成侵染垫的能力与对照1980相比减弱，表现为侵染垫出现的时间延迟，形成的侵染垫的数量减少，进一步表明ssbmr1基因在核盘菌侵染垫形成过程中具有重要作用。

5.3ssbmr1沉默转化子菌核观察

将ssbmr1沉默转化子及对照菌株1980在正常pda培养条件下培养至第三代，生长10d后，分别观察菌核的产生情况，并在培养25d后收集菌核，并对菌核的数量和质量进行统计(图15)。结果显示，基因ssbmr1沉默转子菌核的发生及产生菌核的质量和数量落后于野生型菌株1980。

5.4ssbmr1沉默转化子致病性分析

随机选取编号为bmr1-1，bmr1-14，bmr1-26的转化子以及野生型1980菌株对甘蓝型油菜中双11的茎秆进行接种，在接种后96h对病斑大小进行统计，分析转化子相对于1980的致病力(图16)。结果显示与1980相比，所选用的3个转化子接种后病斑面积大小均显著较小，干扰ssbmr1基因表达后，核盘菌致病能力显著减弱。

随机选取编号为bmr1-1，bmr1-26，bmr1-32的转化子以及野生型1980菌株对甘蓝型油菜中双11的叶片进行接种，并在接种后48hpi(hourspost-inoculation)对病斑大小进行统计，分析转化子相对于1980的致病力(图17)。结果显示，与1980相比，所选用的3个转化子接种后病斑面积大小均显著较小，致病能力显著减弱。

将上述接种甘蓝型油菜茎秆和叶片过程中表现稳定的编号为bmr1-1，bmr1-26的两个转化子以及对照1980接种生长4-5周龄的拟南芥叶片，并在接种后24hpi，对菌斑大小进行统计，分析转化子相对于1980的致病力(图18)。结果显示，与对照1980相比，转化子接种后形成的病斑大小显著减小，对拟南芥叶片的致病力减弱。

5.5ssbmr1沉默转化子对不同杀菌剂的敏感性分析

分别用经浓度为1×106μg/l的三唑酮(triazolone)、0.5×104μg/l多菌灵(carbendazim)、1×104μg/l啶酰菌胺(boscalid)原药处理的pda培养基培养转化子及对照1980，观察核盘菌对不同杀菌剂的敏感情况(图19)。结果发现与在普通pda培养基上生长，转化子及1980的生长状态均受到抑制，生长较为缓慢，在三唑酮、多菌灵处理的条件下，转化子与1980生长没有显著差异，但在啶酰菌胺杀菌剂处理的条件下，转化子与1980相比生长速度明显降低，表现干扰ssbmr1基因表达后，核盘菌对啶酰菌胺的敏感性增加。

实施例6农杆菌介导的拟南芥遗传转化

6.1拟南芥的培养

(1)营养土在121℃高温灭菌40min，冷却后，移至花盆中，再用配好的营养液浸透灭菌后的土壤；

(2)4℃春化2天的拟南芥种子播种于灭菌后的土壤中，并用保鲜膜封好，以防水分丢失；

(3)播种后移至光照培养箱中(时间：16h/8h；湿度：40％/60％；温度：22℃/16℃；光照：10000lx/0lx)，种子萌发后去掉保鲜膜，每周浇一次营养液和一次水，直至拟南芥开花结果。

6.2flowerdip法转化拟南芥

(1)取1ml含重组质粒r-higs的农杆菌菌液于100ml含kana的lb液体培养基中28℃，200rmp震荡培养12h；

(2)5000rmp室温离心20min，弃上清，用等体积的5％蔗糖溶液重悬农杆菌沉淀，再加0.2‰的表面活性剂，混匀；

(3)剪掉拟南芥荚果及开花，将拟南芥花序浸于重悬的农杆菌菌液30s，盖上保鲜膜，暗处理1d；

(4)去掉保鲜膜，移到光照培养箱中正常培养；

(5)一周后，重复步骤(1)～(5)再次转化，并且如此重复两周。

(6)当拟南芥荚果开始变黄裂开时，搜集脱落的种子，并于干燥通风的地方干燥种子。当植株整体上干枯时，将整个植株剪下，包好，置于烘箱中30℃烘2d，收集种子，种子4℃存放。

6.3阳性苗检测

在t0代种子中，绿色荧光透过红色滤光片，肉眼可见暗色和显红光的种子，挑选显红光的种子出来单独播种。将t0代种子直播于营养土中，获得t1代植株，光照培养箱中培养，苗期取其叶片提dna，使用引物组合ssbmr1higsf+ssbmr1rnair进行鉴定pcr鉴定(图20)，若其在±400bp有明显条带，则为转基因成功的阳性苗。结果显示，本研究共鉴定获得23个转基因阳性拟南芥植株。

实施例7转基因拟南芥表型观察

播种哥伦比亚野生型种子和转基因t3代种子，在生长4-5周龄时，对拟南芥叶片接种核盘菌1980，在接种核盘菌后24h分别统计野生型和转基因植株病斑面积并进行统计学分析，计算相对于野生型拟南芥抗病性，抗性值越小，表明植株的抗病性越强(图21)。结果显示，与野生型拟南芥相比，3个转基因株系病斑面积均显著减小，相对野生型，对菌核病的抗性显著增强，表明通过在拟南芥中产生靶标核盘菌ssbmr1基因的dsrna可有效增强拟南芥的菌核病抗性。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

sequencelisting

<110>西南大学

<120>核盘菌ssbmr1基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用

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<170>patentinversion3.3

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网址: 核盘菌SsBMR1基因及其在植物菌核病抗性育种中的应用的制作方法 https://www.huajiangbk.com/newsview468170.html