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一种蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒的制作方法

来源：花匠小妙招时间：2024-11-09 03:15

本发明涉及生物技术相关技术领域，特别是涉及一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒。

背景技术

ⅰ型过敏症也称ⅰ型超敏反应性疾病，有关的疾病包括特应性疾病、变应性鼻炎、过敏性结膜炎、特应性皮炎和过敏性哮喘(外源性)和一些荨麻疹、胃肠道食物反应和全身性过敏反应等。ⅰ型过敏症在世界范围内普遍存在，患特应性疾病的患者对吸入或摄入的物质(过敏原)产生由ige抗体介导的超敏反应，而这些物质对无特应性疾病的人是无害的。除特应性皮炎外，通常ige抗体会介导超敏反应。

引发ⅰ型过敏症的物质称为过敏原，是蛋白、糖蛋白或多肽。从粘膜摄入后，这些过敏原与结合在致敏个体的肥大细胞表面上的ige抗体反应。如果两个ige抗体通过过敏原彼此交联，就会导致效应细胞释放介质(如组胺、前列腺素)和细胞因子，从而产生相应的临床症状。

过敏原的命名是根据物种的属和种国际免疫学会联合会(i.u.i.s)下属的过敏原命名专门委员会(allergennomenclaturesub-committee)(http://www.allergen.org)制定了系统的命名规则。命名主要根据过敏原来源物种的拉丁名，所在属名的前三个字母加种的1-2个字母，然后加过敏原代号，如北艾(artemesiavugaris)的过敏原为artv1～artv7，黄花蒿(artemesiaannua)类似的过敏原为artan1～artan7。

蒿花粉是中国北方和西部主要的吸入类致敏原，引起夏秋季过敏人群的鼻炎，结膜炎、皮疹、哮喘等过敏性疾病。如果不进行早期免疫治疗，约有50％蒿花粉过敏患者发展为较为严重的哮喘。由于环境中花粉数量增加和人们生活方式的改变，我国近20年蒿花粉过敏发病率呈现上升和低龄化倾向。

目前在蒿属花粉上已经鉴定出7种过敏原蛋白(artv1～artv6，artan7)。体外诊断主要是用花粉的提取物。我国蒿属(artemisia)过敏源的主要种类为黄花蒿(a.annua)，艾蒿(a.arygi)，茵陈蒿(a.capillaries)，裂叶莲蒿(a.gmelinii)，野艾蒿(a.lavandulifolia)，大籽蒿(a.sieversiana)，欧洲蒿属植物种类主要为北艾(a.vulgaris)，仅在我国宁夏等西北部有少量分布，目前进入我国蒿诊断试剂市场的国外品牌赛默飞世尔科技公司的试剂immunocap所用的材料就是北艾，该方法是一种荧光酶联免疫法，该系统将过敏原吸附在一种被称为immunocap的新型固体上，后者是装在小胶囊中的亲水性载体聚合物，由溴化氧活化的纤维素衍生物合成，与过敏原有很好的结合能力。该系统灵敏性和特异性较高，临床认可度较好。蛋白组分在国外有科研应用性两种(artv1和artv3)。

发明人前期研究发现两种新的组分，其一是：公开号为cn106967696a的中国发明专利公开了一种蒿属植物花粉的过敏原，为蒿属植物的半乳糖氧化酶(artan7)，在我国7种蒿属植物中，氨基酸序列相似性(identity)达到94.1％，各物种来源的半乳糖氧化酶均具有相似的致敏性。其二是：artar2，已列入世界卫生组织过敏原名录。

目前并没有很好的分析过敏性哮喘发生风险的方法，而以蒿花粉提取物作为检测ige抗体水平不足以分析过敏性哮喘发生的风险。

技术实现要素：

本发明针对现有技术中存在的不足，提供了一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合、应用及试剂盒。

一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的蒿属植物花粉过敏原组合，包括artv1、artar2、artv3和artan7。

本发明又提供了所述蒿属植物花粉过敏原组合在预测蒿过敏患者哮喘发生风险中的应用。

本发明还提供了一种用于预测蒿过敏患者哮喘发生风险的试剂盒，包含如权利要求1所述的蒿属植物花粉过敏原组合。

优选的，所述试剂盒为使用immunocap检测方法进行检测，所以过敏原artv1、artar2、artv3和artan7均偶联有生物素，所述试剂盒还包括偶联链霉素的immunocap。

优选的，过敏原artv1、artar2、artv3和artan7均为天然过敏原提取纯化所得。天然过敏原最能代表过敏原真实的情况，检测结果更加准确。

所述的试剂盒，检测方法为：

(1)使用immunocap检测方法分别检测蒿过敏患者血清中各过敏原artv1、artar2、artv3和artan7的特异性ige含量；

(2)ige≥0.35kua/l判定为阳性，若待检测蒿过敏患者血清中至少三种过敏原特异性ige为阳性，则该蒿过敏患者具有过敏性哮喘高发风险。

其中，步骤(1)中，将偶联有生物素的各过敏原分别与蒿过敏患者血清样品混合后，加入偶联链霉素的immunocap孵育后进行检测。

检测使用immunocap-100仪器检测。该仪器为瑞典赛默飞世尔公司(thermofisher)购买，与该公司销售的immunocap方法相关试剂配套使用。

本发明通过对240例蒿花粉过敏病例研究发现使用artv1、artar2、artv3和artan7四个过敏原组分所测得的特异性ige值总和与欧洲蒿花粉提取物特异性ige值之间具有很高的相关性，相关系数r＝0.92，只有少数血清缺失相应的组分，但这些病例多是过敏症状较轻，因此这四个组分有充分的代表性。

进一步分析发现，当蒿花粉过敏病例检测结果中，artv1、artar2、artv3和artan7中的三个或者四个全部过敏原均为阳性的情况下，过敏性哮喘发生率为57％，而这四个过敏原阳性数少于3个时，过敏性哮喘发病率为24％，前者是后者的2.4倍。所以若待检测蒿过敏患者血清中三种或者四种过敏原特异性ige均为阳性，则该蒿过敏患者具有过敏性哮喘高发风险。

蒿花粉过敏季节性哮喘严重影响生活质量，因此正确评判过敏症状的严重程度风险有重要临床诊断价值。通过对过敏患者进行检测，经检测判断具有高过敏性哮喘发生风险的病人，需要药物控制以及脱敏治疗才有可能根除，从而避免过敏性哮喘的发生。

附图说明

图1为过敏原artar2的电泳检测结果图。

图2为过敏原artar2的胰蛋白酶处理后多肽片段lc-ms质谱检测结果图。

图3为immunocap检测的流程图。

图4为蒿花粉提取物特异性ige值与四个组分相加之和的线性关系图，其中sx、sd、yn分别代表来至山西、山东和云南。

图5为不同年龄段非哮喘(灰色柱)与哮喘(黑色柱)发生比例分布图。

图6为蒿花粉过敏性哮喘和非哮喘病人的蒿花粉提取物以及四种组分ige值比较，其中，实心点为哮喘组，空心为非哮喘组。

图7为蒿花粉过敏原组分阳性数量与病症发生比率的关系，其中，0-4代表测试的4个过敏原(artv1、artar2、artv3、artan7)有几个为阳性ige(≥0.35kua/l视为阳性)，过敏性哮喘(asthma)、结膜炎(conjunctivitis)、鼻炎(rhinitis)、皮疹(eczema)。

图8为四种组分检测阳性率与哮喘发生的关系图。

具体实施方式

北艾(w6)及其组分artv1(w231)和artv3(w233)immnuocap：购自瑞典赛默飞世尔公司(thermofisher)(货号分别为14-4103-1；14-4970-01；14-4938-01)。

artar2(genbank号为mf326217)为使用特异单抗免疫纯化所得。

artan7(genbank号为ky428925)来源于黄花蒿花粉提取纯化(具体见公开号为cn106967696a的中国发明专利)。

artar2和artan7特异性ige测试需要应用购自瑞典赛默飞世尔公司(thermofisher)的链霉亲和素cap(streptavidincap，代码o202，货号14-5320-01)。以0.5μg天然纯化的artar2或artan7加入streptavidin-conjugatedimmunocap(o212)中37℃温育1小时。

蒿花粉过敏病例来至山西(sx1～178)，山东(sd1～30)和云南(yn1～32)。本研究经各伦理委员会批准：浙江大学附属第二医院(授权号2011-r-1，2013-67-087)、山西省大同市第三人民医院(授权号2015-001)和山东省烟台毓璜顶医院(授权号2015-164)。过敏性症状诊断分为四种，鼻炎，眼结膜炎，皮疹，过敏性哮喘。

实施例1

artar2分离纯化，应用一个鼠单抗c9-c1免疫亲和分离。

单抗的来源是用100μg艾蒿花粉蛋白提取物各免疫5只小鼠(scxk(hu)2012-002，中国)，每隔7-14日即注射50μg蒿蛋白提取物，共六次。根据免疫印迹和elisa筛选获得3个单克隆抗体，其中2个结合artv3，一个结合一个分子量大小约为16kda的蛋白。取适量cnbr-activatedsepharose4fastflow(gehealthcare)加入4倍体积冷1mmhcl，搅拌并除去液体，ddh2o清洗后与透析至偶联缓冲液的c9-c1单抗混匀，4℃过夜偶联，测定溶液中未偶联蛋白浓度以确定偶联效率，并用至少5倍体积的偶联缓冲液洗去多余配体，将介质转至0.1mtris-hcl溶液(ph8.0)中，4℃过夜封闭未结合位点，然后用3倍体积洗液a-3倍体积洗液b的顺序清洗，重复3-6次，装入ccolumn(gehealthcare)配合akta系统(gehealthcare)进行纯化。艾蒿花粉蛋白提取物冻干后用5ml0.1mtris-hcl溶液(ph8.0)溶解，0.45μm滤膜过滤后上样，室温孵育半小时后用0.1mtris-hcl溶液(ph8.0)冲洗至a280＝0，在收集管中加入适量0.5mna2hpo4溶液调节ph值，0.1m甘氨酸(ph2.4)洗脱，结束后用0.01mpbs溶液(ph7.4)平衡。蛋白洗脱液用sds-page电泳检测(图1)，透析至pbs溶液中冻干后用bca法测定蛋白浓度，lc-ms质谱匹配(上海中科生命科技)，确认为过敏原artar2(见图2)，genbank序列号mf326217。

实施例2

artv1和artv3的检测直接参照immnuocap产品说明书。

天然过敏原artar2和artan7的immunocap检测：纯化出的天然过敏原artar2和artan7与生物素链接后，以0.5μg/cap的量加入streptavidin-conjugatedimmunocap(o212)中37℃温育1小时，吸去残留液体备用(erwin等，2005)。

特异性ige抗体含量由immunocap(thermofisher、usa)测定，检测的蒿过敏原为北艾提取物(w6)和过敏原组分nartv1(w231)、nartv3(w233)、nartar2和nartan7，血清用量40μl，sige≥0.35kua/l视为阳性。操作过程和方法以及标准曲线和阳性质控参照immnuocap100产品说明书。测试流程见图3。病例信息和ige体外测试结果见表1。

统计分析方法：数据由spss21.0(美国ibm)软件进行分析，graphpadprism7.0软件绘制图，组间ige抗体结合率差异由χ2检验或fisher精确检验(若n<5)计算，ige抗体等级则由mann-whitneyu检验计算，相关性分析采用spearman秩相关检验方法，不同地区间的定量变量差异则由kruskal-wallis检验比较，p<0.05视为有显著统计学差异。

表1山西、山东、云南240例蒿花粉过敏病例症状和血清ige测试结果数据。

注：症状代号，as-哮喘；c-结膜炎；r-鼻炎；e-皮疹。

实施例3

目前蒿花粉过敏原组分有7个(artv1–artv7)，瑞典赛默飞世尔公司(thermofisher)immunocap检测商业化组分只有2个：artv1和artv2。本发明所测的四个过敏原组分所测值的总和与欧洲蒿提取物w6(货号14-4103-1)测定值(表1数据)有极高的相关性(r＝0.92，见图4)。只有少数血清缺失相应的组分，但这些病例多是过敏症状较轻。因此这四个组分有充分的代表性。

实施例4

山西和山东的蒿过敏病ige值在提取物和组分都明显高于云南的病例，哮喘患病率(40％-58％)比云南病人(6％)高很多(表2)，可能与气候环境、食物构成和致敏原组分差异等多方面因素有关，云南病人的结膜炎患病率较高，而对这四种蒿过敏的组分数目更少，可能对另外三种未检测的蒿组分过敏原敏感。

表2三个省征集蒿花粉过敏患者症状和ige测定值的比较。

实施例5

蒿花粉过敏患者一部分会从开始轻微的鼻炎发展为哮喘，根据表1数据，蒿花粉过敏性哮喘发生与年龄有关(图5)。儿童青少年(2-18岁)发生哮喘较少，在20％以下，成年组(19-61岁)发生的比例达到65％。

蒿花粉过敏季节性哮喘严重影响生活质量，这些病人需要药物控制以及脱敏治疗才有可能根除。因此正确评判过敏症状的严重程度风险有重要临床诊断价值。蒿花粉提取物(mugwortextract)中位数指示，哮喘(asthma)比非哮喘(non-asthma)的病人ige值较高，在三个组分artv1、artv3和artan7有显著差异，尤其是artv3极显著(图6)。进一步分析发现对蒿花粉过敏原多个组分过敏的发生哮喘的比例显著提高(图7，图8)。

在所测试病例中，哮喘病例组78％的病人对3-4个组分ige阳性，0-2个组分阳性的仅占22％。相反，在非哮喘病例组中，0-2个组分阳性率为46％，3-4个组分阳性率为54％，二者没有显著差异。混合所有蒿过敏病例也得出0-2个组分阳性，过敏性哮喘发病率为24％；3-4个组分诊断为阳性的过敏性哮喘发生率57％，是前者的2.4倍。在所测试的四个组分中，有三个组分检测为阳性率与哮喘发生关联度关系达到极显著水平，分别是artv1(or，3.26；95％ci，1.53-6.94；p＝0.002)，artv3(or，2.77；95％ci，1.63-4.72；p＝0.001)和artan7(or，3.28；95％ci，1.58-6.78；p＝0.001)。三个过敏原都是主要过敏原，在确诊蒿花粉过敏病例的阳性率分别达到81％，53％和80％。artar2的阳性率位48％，对哮喘的发生也有增加作用，4个组分全部为阳性哮喘发生的比例略高于3个组分为阳性(图7)。进一步分析四个组分的阳性率在哮喘组均高于非哮喘组(图8)。

进一步分析发现，当蒿花粉过敏病例检测结果中，artv1、artar2、artv3和artan7中的三个或者四个全部过敏原均为阳性的情况下，过敏性哮喘发生率为57％，而这四个过敏原阳性数少于3个时，过敏性哮喘发病率为24％，前者是后者的2.4倍。