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马银花等杜鹃花组织培养及干细胞相关基因克隆与表达

来源：花匠小妙招时间：2024-11-08 15:22

　　杜鹃花是一种重要的观赏植物,具有一定的园林绿化及药用价值。本实验室已经对多种杜鹃花的组织培养进行了一系列研究,在前人研究的基础上,本研究以马银花(Rhododendron ovatum Planch.)和满山红(Rhododendron simsii)试管苗为材料,对马银花的离体繁殖进行研究,并对满山红的离体繁殖体系进行优化；同时以马银花愈伤组织为材料,对植物干细胞相关基因RoWUS和RoCLV1的cDNA全长序列以及RoWUS基因的gDNA及启动子序列进行克隆,并利用实时荧光定量PCR技术对RoWUS和RoCLV1基因在马银花愈伤组织不同培养阶段以及不同激素处理下的表达水平进行定量表达分析。主要结果如下：1马银花等杜鹃花离体繁殖体系的优化以马银花和满山红试管苗为材料,对马银花试管苗的增殖、生根以及叶片愈伤组织的诱导进行研究,并优化满山红试管苗增殖、生根体系。①比较不同基本培养基、ZT、NAA、TDZ对马银花和满山红增殖的影响,正交试验结果表明：WPM+ZT2.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.5mg/L对马银花试管苗增殖效果最佳,增殖系数最高,达到12.92,平均株高为1.89cm,叶片较大,茎粗壮,呈深绿色；WPM+ZT4.0mg/L+NAA0.2mg/L+TDZ1.0mg/L对满山红试管苗增殖效果最佳,增殖系数最高,达到8.27,平均株高为1.73cm,叶片大,茎鲜嫩粗壮,呈嫩绿色。②比较不同基本培养基、NAA.IBA.AC对马银花和满山红生根的影响,正交试验结果表明：1/4WPM+IBA1.0mg/L+NAA0.0mg/L+AC3.0g/L对马银花试管苗生根影响最佳,平均根数最多为9.86条,平均根长为1.83cm;1/4WPM+IBA1.0mg/L+NAA0.0mg/L+AC3.0g/L对满山红试管苗生根影响最佳,生根率达到100%,平均根数最多为10.71条,平均根长为1.52cm。③比较不同基本培养基、ZT、NAA、2,4-D对马银花叶片愈伤组织诱导的影响,正交试验结果表明：WPM+ZT1.0mg/L+NAA0.15mg/L+2,4-D1.0mg/L对马银花愈伤组织诱导效果最佳,诱导率为62.22%,愈伤组织浅绿色、疏松,生长状况优良,诱导所需时间最短。2马银花愈伤组织RoWUS基因及其启动子的克隆与分析采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到RoWUS cDNA全长序列,登录号为KF365488。马银花RoWUS cDNA全长1123bp,其中5'-UTR长度为101bp,3'-UTR长度为94bp,以ATG为起始密码子,TAA为终止密码子,Poly(A)尾长18bp,编码302个氨基酸。RoWUS蛋白相对分子量为33422.5Da,理论等电点(pI)5.81,分子式为C1444H2186N416O477S13,亚细胞定位于细胞核的可能性最高,是不稳定的亲水蛋白,无信号肽,具有跨膜结构,包含homeodomain功能位点。二级结构预测表明该蛋白以无规则卷曲结构为主,所占的比例为74.83%,其次为α螺旋结构占15.23%,延伸链所占的比例较少,为9.93%。由三维结构预测可知,该蛋白的主要结构元件是无规则卷曲、α螺旋和延伸链,与二级结构预测结果相符。系统进化树分析表明RoWUS单独形成一个分支,与葡萄、大豆和苜蓿的亲缘关系最近。采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到RoWUS gDNA序列,序列长2001bp,包含2个内含子和3个外显子,3个外显子在DNA序列上的位点分别是1-370；831-946；1579-2001。采用染色体步移法从马银花愈伤组织中克隆得到RoWUS基因的启动子序列,启动子长3122bp,登录号为KF861578。核心启动子区域预测结果表明RoWUS启动子具有多个核心启动子区域,其中最可能的核心启动子区域为GTCGTTCATATATATATTTATGCCCGATCAAT CTGATTTTTCTCTGCGAT,可能的转录起始位点位于翻译起始位点上游-1381bp处的T(将起始密码子ATG中的A定义为位+1)。该启动子中核心元件TATA-Box有57个、CAAT-Box有27个,另外还含有多个光响应元件、逆境胁迫响应元件、激素应答元件和其他功能元件。3马银花愈伤组织RoCLV1基因的克隆与分析采用同源克隆法结合RACE技术从马银花愈伤组织中克隆得到RoCLV1cDNA全长序列,登录号为KF861577。马银花RoCLV1cDNA全长3526bp,其中5'-UTR长度为169bp,3'-UTR长度为363bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TGA, Poly(A)尾长8bp,编码992个氨基酸。RoCLV1蛋白相对分子量为109589.3Da,理论等电点(pI)8.62,分子式为C4933H7845N1317O1437S31, RoCLV1蛋白亚细胞定位于细胞质膜的可能性最高,具有信号肽和跨膜结构,是不稳定的亲水蛋白,含有Pkinase和PROTEIN_KINASE_DOM结构域。二级结构预测表明RoCLV1蛋白以无规则卷曲为主,所占的比例为51.71%,其次为α螺旋结构占33.77%,延伸链所占的比例较少,为14.52%。由三维结构预测可知,该蛋白的主要结构元件是无规则卷曲、a螺旋和延伸链,与二级结构预测结果相符。系统进化树分析表明马银花RoCLV1与葡萄亲缘关系最近,形成一个分支,与草莓、碧桃、番茄、马铃薯等的亲缘关系较近。4马银花愈伤组织生长过程中干细胞相关基因的定量表达分析以EF-1a为内参基因,用荧光定量PCR法对RoWUS和RoCLV1基因在马银花愈伤组织不同培养阶段及不同激素处理下的表达情况进行分析。试验结果表明：RoWUS和RoCLV1基因在马银花愈伤组织不同培养阶段均有表达,且无论是不同继代周期还是同一继代周期不同天数中RoWUS的相对表达量都比RoCLV1的相对表达量要高,可以推测在马银花愈伤组织的发生过程中,RoWUS基因在干细胞维持和分化的调控途径中可能起到重要作用,进而对愈伤组织的分化起重要调控作用。一个继代周期内不同天数和不同继代周期中RoWUS基因的表达量变化趋势相似。一个继代周期内RoWUS基因在第25d时表达量最高,不同继代周期中RoWUS基因在第5代表达量达到峰值,而此时马银花愈伤组织结构疏松,颜色浅而透明,说明该愈伤组织可能在该时期处于细胞分裂旺盛期。RoCLV1在第10d、30d和45d时候出现3个峰值,说明RoCLV1对马银花愈伤组织在不同时间的细胞分裂有不同的影响。用赤霉素和脱落酸处理马银花愈伤组织时RoWUS和RoCLV1基因的相对表达量变化趋势一致。赤霉素浓度较低时RoWUS和RoCLV1基因的响应比较弱,但是随着赤霉素浓度的提高,RoWUS和RoCLV1基因对赤霉素响应逐渐增强,在浓度为15mg/L时响应最强,浓度进一步增加时又降低。这可能是试验所用的培养基中含有活性较高的细胞分裂素和一定浓度的生长素导致的。用低浓度ABA处理时RoWUS和RoCLV1基因相对表达量稳定,但是当ABA浓度从10mg/L增加到15mg/L时RoWUS和RoCLV1基因相对表达量迅速增加。说明此浓度范围是RoWUS和RoCLV1基因中ABA元件响应的最佳浓度,可以促进愈伤组织细胞快速分裂。用水杨酸处理时RoWUS的相对表达量较低,RoCLV1的相对表达量较高且变化较大,这可能是因为CLV1与WUS之间存在较为复杂的调控关系。

[关键词]：

杜鹃花;RoWUS;RoCLV1;克隆;内含子;启动子;荧光定量PCR

[文献类型]：硕士论文
[文献出处]：

福建农林大学2014年