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多花黑麦草抗病基因类似物的克隆及CAPS标记

来源：花匠小妙招时间：2024-11-04 22:32

多花黑麦草抗病基因类似物的克隆及CAPS标记丁成龙1,2,沈益新2$,顾洪如1,三浦優一3(1.江苏省农业科学院畜牧研究所,江苏南京210014;2.南京农业大学动物科技学院,江苏南京210095;3.日本畜产种子协会饲料作物研究所,日本!木3292742))摘要:多花黑麦草具有适应性强、生物产量高和品质好等优点,为我国南方及其他温带地区重要的牧草。本研究利用目前已克隆出的抗病基因(R基因)所编码的蛋白质结构上所具有的共同氨基酸基序NBSLRR设计寡核苷酸简并引物,对多花黑麦草基因组进行抗病基因类似物(RGA)克隆。从克隆中筛选出具代表性的RGA克隆115个,设计RGASTS引物113对。利用细胞质雄性不育(CMS)F1群体对RGASTS引物进行筛选,并采用限制性内切酶酶切扩增多态序列(CAPS)法进行抗病类似物的分子标记,共检测到22对RGASTS引物的扩增产物具多态性,22个RGACAPS标记均被标记于多花黑麦草遗传连锁图中。结果还表明RGA在多花黑麦草遗传连锁图中分布范围较广,并具有簇状分布特性。关键词:多花黑麦草;抗病基因类似物;酶切扩增多态序列(CAPS);遗传连锁图中图分类号:S543+.603.53;Q943.2文献标识码:A文章编号:10045759(2006)03010708$目前从植物中克隆出抗病基因30多个,这些基因在植物体内分别表现出对细菌、真菌、病毒以及线虫等具有抗性[17]。根据这些基因所编码的蛋白质结构上的异同,可将其分为4大类,即:含有核苷酸结合位点(NBS)和富亮氨酸重复(LRR)的胞外受体蛋白基因;丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(STK)基因;含有胞外LRR结构的胞内受体蛋白基因以及同时含有胞外LRR和胞内STK结构的跨膜受体蛋白基因[8]。其中绝大多数抗病基因均含有一个核苷酸结合位点(NBS)和一个富亮氨酸重复(LRR)基序[914],Meyers等[9]发现抗病基因(R基因)中NBS序列保守结构域中有多达7种基序,其中包括P环、激酶2a和GLPL等。由于这些保守结构域的存在使得通过设计简并寡核苷酸引物和应用PCR进行抗病基因类似物的克隆成为可能。目前利用这种方法已成功地从水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、马铃薯(Solanumtuberosum)、小麦(Triticumaestivum)、大麦(Hordeumvul-gare)和大豆(Glycinemax)等多种作物中获得了抗病基因类似物[1520]。植物基因组中抗病基因类似物的数量较多,通过拟南芥(Arabidopsisthaliana)和水稻的基因组分析,NBSLRR类序列在单子叶和双子叶植物基因组中表现出超基因家族特征,拟南芥基因组中大约有300个同NBSLRR相关的序列,而从水稻基因组计划已公布的序列中发现大约有100个同NBSLRR相关的序列[9]。利用简并寡核苷酸引物和应用PCR所克隆出的抗病基因类似物经常聚集在已被识别的抗性位点上[15,2124],因此通过克隆和识别抗病基因类似物可为植物抗病基因的研究和分子标记辅助基因克隆提供一条有效的途径。多花黑麦草(Loliummultiflorum)因其营养丰富,生物产量高,适口性好,多种草食家禽、家畜均喜食等优点而被广泛种植,为我国最重要的冷凉季牧草种之一[2530]。随着多花黑麦草栽培面积的扩大,病害时有发生且越来越受到重视,目前多花黑麦草上存在的主要病害有叶斑病(Pyriculariasp.),冠锈病(Pucciniacoronata)和纹枯病(Rhizoctoniasolani)等,所有这些病害的发生不仅影响鲜草产量、质量,而且也严重影响其适口性,从而对草食畜禽的发展造成一定的影响[32,33],因此对多花黑麦草的抗病性研究具有非常重要的意义。另外,多花黑麦草同高羊茅(Festucaarundinacea)和草地羊茅(F.pratensis)相比,其基因组相对简单[34],对其抗病基因类似物第15卷第3期Vol.15,No.3草业学报ACTAPRATACULTURAESINICA107-1146/2006

$收稿日期:20041108基金项目:国家重点基础研究发展规划项目(G2000018603)资助。作者简介:丁成龙(),男,江苏滨海人,副研究员,在读博士生。: