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硬枝树花的化学成分及抗氧化研究

来源：花匠小妙招时间：2024-11-03 08:08

地衣是菌物的重要组成部分之一,自古以来很多地衣种类在中国民间用于食用或药用。硬枝树花Ramalina conduplicans Vain.就是其中的一种,隶属于子囊菌门Ascomycota,子囊菌纲Ascomycetes,茶渍目Lecanorales,树花科Ramalinaceae,树花属Ramelina（付伟 2008）。地衣体树生,灌丛状,是地衣型真菌,主要生长于我国广西、吉林、黑龙江、西藏、新疆、云南等地（付伟 2008）。云南地区食用的“树花菜”,其中一种就是硬枝树花。根据民间调查“树花菜”具有能控制血糖、抑制脂肪细胞堆积、降低血压、增强免疫力作用。地衣类化学成分多样,本研究对硬枝树花进行了化学成分分析,分离鉴定了6个化合物,均为首次从该地衣植物中分离得到,并且对这6种成分进行了抗氧化活性研究。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料

旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂）;手提式紫外分析仪WFH-204B（上海精科实业有限公司）;Unity-400超导核磁共振波谱仪（美国）;Sephadex LH-20（瑞典Pharmacia公司）;柱层析硅胶（80-120目,200-300目）（青岛海洋化工厂）;薄层层析硅胶GF254（青岛海洋化工厂）;iMark酶标仪（美国BIO-RAD伯乐公司）;总抗氧化能力检测试剂盒（ABTS法）（碧云天生物技术研究所）;2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（兰州百源基因技术有限公司）;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（兰州百源基因技术有限公司）;其他试剂均为分析纯。

硬枝树花采集于云南哀牢山,由中国科学院昆明植物研究所王立松研究员鉴定为硬枝树花Ramalina conduplicans Vain.,凭证标本存放于吉林农业大学标本馆（No. HMJAU24947）。

1.2 提取分离

硬枝树花干燥体500g,粉碎后加石油醚（30-60）38℃回流提取3次,减压回收溶剂,浓缩得浸膏2.9g。剩余残渣加二氯甲烷45℃回流提取3次,浓缩得4.08g浸膏。剩余残渣加乙酸乙酯55℃回流提取3次,得浸膏8.475g。石油醚浸膏经硅胶柱色谱,环己烷:乙酸乙酯（100:0-0:100）梯度洗脱,得化合物1（32mg）、化合物2（12mg）。二氯甲烷浸膏经硅胶柱色谱,石油醚（60-90）:丙酮（100:0-0:100）梯度洗脱,得2个组分E1、E2,E1经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷:甲醇（3:2）洗脱,并重复多次纯化,得到化合物3（10mg）和化合物4（16mg）,E2经Sephadex LH-20柱色谱,二氯甲烷:甲醇（3:2）洗脱,得化合物5（13mg）。乙酸乙酯浸膏经硅胶柱色谱,二氯甲烷:甲醇（10:1-1:1）梯度洗脱,得组分E3,E3经硅胶柱色谱,环己烷:丙酮（2:1-1:1）梯度洗脱得E3-1,E3-1经硅胶柱色谱,环己烷:丙酮（4:1）梯度洗脱,反复纯化得化合物6（2g）。

1.3 抗氧化实验

1.3.1 DPPH法：参照张汇等（2011）的实验方法并进行改进。0.1mmol/L DPPH的配制：称取0.01g DPPH用80%乙醇定容50mL,浓度为0.2mg/mL,准确量取1mL定容至50mL,浓度为0.04mg/mL,即0.1mmol/L。BHT标准品配制：将BHT用80%乙醇配制初始浓度为1.2mmol/L、0.6mmol/L、0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.075mmol/L。样品溶液的配制：将化合物1-6用80%乙醇配制成初始浓度为1.2mmol/L、0.6mmol/L、0.3mmol/L、0.15mmol/L、0.075mmol/L。

测定步骤：在96孔检测板中加入样品,方法如下：A组为各个浓度化合物1-6及BHT各20µL和200µL 80%乙醇;B组为80%乙醇20µL和200µL DPPH;C组为各个浓度化合物1-6及BHT各20µL和200µL DPPH。室温下避光静置30min,酶标仪测定517nm处吸光度。

清除率=[1-(FC-FA)/FB]*100%

1.3.2 ABTS法：参照李培源等（2011）的实验方法并进行改进。ABTS工作液的配制：准确量取400µL ABTS溶液,400µL氧化剂溶液,得ABTS工作母液,室温避光保存16h。使用前,把ABTS工作母液用80%乙醇稀释成ABTS工作液,工作液的吸光度减去80%乙醇空白对照后,用紫外分光光度计测定734nm处的吸光度为0.745。Trolox标准溶液的配制：将10mmol/L Trolox标准溶液稀释成初始浓度为0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mmol/L。ABTS·+自由基清除率计算公式如下：

清除率=(A0-A)/A0*100%

式中：A0为ABTS·+溶液的吸光度,A为加药液后的吸光度。

测定步骤：（1）96孔板的每个检测孔中加入200µL ABTS工作液;（2）空白对照孔中加入10µL 80%乙醇,标准曲线检测孔内加入10µL各种浓度的Trolox标准溶液,样品检测孔内加入10µL各种样品,轻轻混匀;（3）室温孵育6min后测定734nm处波长。

1.4 统计学分析

数据采用SPSS 19.0统计软件进行处理,实验数据以表示。P<0.05说明在统计学上呈显著差异,P<0.01说明在统计学上呈极显著差异。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1黄色针晶（氯仿）,C18H16O7。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为蓝色。EI-MS：m/z 344.42[M]+,233.42（100）,260.34;1H-NMR（CDCl3,400MHz）δ：18.83（s,1H,OH-3）,13.30（s,1H,OH-7）,11.02（s,1H,OH-9）,5.97（s,1H,H-4）,1.75（s,3H,CH3-9b）,2.66（s,3H,CH3CO-2）,2.09（s,3H,CH3-8）,2.67（s,3H,CH3CO-6）。13C-NMR（CDCl3,100MHz）δ：198.0（C-1）,105.2（C-2）,191.7（C-3）,98.3（C-4）,179.3（C-4a）,155.2（C-5a）,101.2（C-6）,163.8（C-7）105.2（C-8）,7.4（CH3-8）,157.4（C-9）,103.9（C-9a）,59.0（C-9b）,31.2（CH3-9b）,201.7（CO-6）,27.8（CH3CO-2）,200.3（CO-2）,32.1（CH3CO-6）。碳谱和氢谱的数据与(+)-松萝酸[(+)-usnic acid]（图1）（Eifler-lima et al. 2000）一致。

图1 化合物1(+)-松萝酸

Fig. 1 Compound 1(+)-usnic acid.

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化合物2白色针晶（丙酮）,C19H18O8。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为粉红色。EI-MS：m/z 374.21[M]+,164.27（100）,196.26（55）,179（42）,150（19）,107（17）,79（20）;1H-NMR（CDCl3,400MHz）δ：12.54（1H,s,4-OH）,12.49（1H,s,2-OH）,11.94（1H,s,2′-OH）,10.36（1H,s,H-9）,6.54（1H,s,H-5）,6.64（1H,s,H-5′）,3.98（3H,s,H3-10）,2.68（3H,s,H3-8′）,2.54（3H,s,H3-8）,2.09（3H,s,H3-9′）。13C-NMR（CDCl3,100MHz）δ：116.0（C - 1）,169.6（C - 2）,110.2（C - 3）,162.8（C - 4）,102.8（C - 5）,151.9（C - 6）,169.0（C - 7）,21.5（C - 8）,193.8（C - 9）,108.5（C - 1′）,167.5（C - 2′）,116.7（C -3′）,152.3（C - 4′）,112.8（C - 5′）,139.8（C - 6′）,172.1（C - 7′）,25.56（C - 8′）,9.35（C - 9′）,52.3（-OMe）。氢谱、碳谱数据基本与黑茶溃素（atranorin）（图2）（丁智慧等1990）数据一致。

化合物3白色粉末（丙酮）,C19H20O7。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为粉红色。EI-MS：m/z 360[M]+,179.29（100）;1H-NMR（Acetone-d6,400MHz）δ：11.4（1H,s,2-OH）,6.71（1H,s,H-5）,2.05（3H,s,H3-8）,2.69（3H,s,H3-9）,3.93（3H,s,4-OCH3）,11.7（1H,s,2′-OH）,6.71（1H,s,H-5′）,2.60（3H,s,H3-9′）,2.03（3H,s,H3-8′）。13C-NMR（Acetone-d6,100MHz）δ：109.9（C-1）,163.5（C-2）,104.6（C-3）,162.7（C-4）,107（C-5）,141.3（C-6）,170.3（C-7）,23.3（C-8）,8.8（C-9）,107（C-1′）,163.9（C-2′）,116.7（C-3′）,153.1（C-4′）,116.7（C-5′）,140.7（C-6′）,173.7（C-7′）,7.4（C-8′）,24.3（C-9′）,55.6（-OMe）。数据与姜北等（2002）报道的巴尔巴地衣酸（barbatinic acid）氢谱和碳谱数据一致（图3）。

图2 化合物2黑茶溃素

Fig. 2 Compound 2 atranorin.

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图3 化合物3巴尔巴地衣酸

Fig. 3 Compound 3 barbatinic acid.

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化合物4白色粉末（丙酮）,C16H14O8。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为粉红色。EI-MS：m/z 332[M]+,165.26（100）;1H-NMR（Acetone-d6,400MHz）δ：11.2（1H,s,2-OH）,6.80（1H,d,J = 2.0Hz,H-3′）6.77（1H,d,J = 1.92Hz,H-5′）6.45（1H,d,J = 2.44Hz,H-5）6.40（1H,d,J = 2.48Hz,H-3）3.86（3H,s,H3-8）,2.65（3H,s,4-OMe）2.63（3H,s,H3-8′）。13C-NMR（Acetone-d6,100MHz）δ：105（C-l）,165.1（C-2）,99.1（C-3）,166.1（C-4）,110.6（C-5）,144（C-6）,169.7（C-7）,23.6（C-8）,112.2（C-l′）,164.9（C-2′）,108.7（C-3′）,154.4（C-4′）,116.7（C-5′）,143.7（C-6′）,173.1（C-7′）,23.3（C-8′）。数据与去甲环萝酸（evernic acid）（图4）（Narui et al. 1998）碳谱、氢谱数据基本一致。

图4 化合物4去甲环萝酸

Fig. 4 Compound 4 evernic acid.

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化合物5白色粉末（氯仿）,C20H22O7。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为淡粉色。ESI m/z：373.3 [M]-;1H-NMR（Acetone-d6,400MHz）δ：12.38（1H,s,2-OH）,6.71（1H,s,H-5）,2.05（3H,s,H3-8）,2.69（3H,s,H3-9）,3.93（3H,s,2-OCH3）,3.89（3H,s,4-OCH3）11.7（1H,s,2′-OH）,6.71（1H,s,H-5′）,2.60（3H,s,H3-8′）,2.03（3H,s,H3-9′）。13C-NMR（Acetone-d6,100MHz）δ：109.9（C-1）,163.5（C-2）,116.7（C-3）,162.7（C-4）,107（C-5）,141.3（C-6）,170.3（C-7）,8.8（C-8）,23.3（C-9）,107（C-1′）,163.9（C-2′）,104.6（C-3′,153.1（C-4′）,116.7（C-5′）,140.7（C-6′）,173.7（C-7′）,7.4（C-8′）,24.3（C-9′）,55.6（-OMe）,62.1（-OMe）。氢谱和碳谱的数据与Bayir et al.（2006）报道的地弗地衣酸（diffractaic acid）（图5）数据一致。

化合物6白色粉末（丙酮/氯仿）,C18H13O10。TLC以5%的浓硫酸-乙醇溶液显色为黄色。EI-MS m/z：389[M]+;1H- NMR（400MHz,DMSO-d6）δ：12.06（s,1H,C-2′,-OH）,10.45（d,2H,J = 12.0Hz,C-3和C-6′,-CHO）,8.31（s,1H,C-4,-OH）,6.88（d,1H,J = 11.8Hz,C-3′,-OH）,6.81（s,1H,C-5）,4.65（s,2H,C-3’,-CH2-）,4.44（m,1H）,4.26 - 4.14（m,1H）,4.05 - 3.94（m,1H）,2.44（d,3H,J = 10.0Hz,-CH3）。13 C-NMR（100MHz,DMSO-d6）δ：111.9（C-1）,165.9（C-2）,110.6（C-3）,164.0（C-4）,117.4（C-5）,152.9（C-6）,160.3（C-7,-CO2-）,21.4（C-8,-CH3）,192.7（C-9,-CHO）,109.7（C-1′）,152.3（C-2′）,123.4（C-3′）,148.1（C-4′）,138.0（C-5′）,137.3（C-6′）,163.6（C-7′,-CO2-）,94.9（C-8′,-CHO）,52.6（C-9′,-CH2OH）。氢谱和碳谱的数据与Ingolfsdottir et al.（1998）报道的藻纹苔酸（salazinic acid）（图6）一致。

图5 化合物5地弗地衣酸

Fig. 5 Compound 5 diffractaic acid.

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图6 化合物6藻纹苔酸

Fig. 6 Compound 6 salazinic acid.

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2.2 单体化合物对DPPH·清除能力的测定

单体化合物由硬枝树花提取分离纯化得到,经鉴定为松萝酸、黑茶溃素、巴尔巴地衣酸、去甲环萝酸、地弗地衣酸、藻纹苔酸。本实验以BHT为阳性对照,分别测定终浓度为3.4375µmol/L、6.875µmol/L、13.75µmol/L、27.5µmol/L、55µmol/L时6个单体化合物的DPPH·清除能力（表1）。

由表1可知,6个单体化合物均有具有一定的清除DPPH自由基能力。其中,藻纹苔酸的DPPH自由基清除率与终浓度呈现一定的量效关系,浓度增大,清除率也相应增大,藻纹苔酸终浓度为55µmol/L时的清除率最大,为57.05%（P<0.01）。终浓度为13.75-55µmol/L时,黑茶溃素、巴尔巴地衣酸、去甲环萝酸的DPPH自由基清除率较高,与终浓度呈现量效关系并不十分明显,与同浓度对照组BHT相比较,均有极显著性差异（P<0.01）。松萝酸终浓度为6.875µmol/L及27.5µmol/L时的清除率较高,接近BHT在终浓度为55µmol/L时的清除率77.36%。

2.3 单体化合物总抗氧化能力的测定（ABTS法）

松萝酸、黑茶溃素、巴尔巴地衣酸、去甲环萝酸、地弗地衣酸、藻纹苔酸6个单体化合物终浓度为6.875µmol/L、13.75µmol/L、27.5µmol/L、55µmol/L,以Trolox为阳性对照,测定6个单体化合物ABTS·+自由基的清除能力（表2）。

由表2可以看出,对照组Trolox的ABTS·+自由基清除率效果最好,在检测浓度范围内ABTS·+自由基清除率与终浓度成一定的量效关系。在测试的6个单体化合物中,地弗地衣酸、藻纹苔酸、巴尔巴地衣酸3种物质随着摩尔浓度的增大,ABTS·+自由基清除率逐渐增大,在终浓度为55µmol/L时,地弗地衣酸的ABTS·+自由基清除率为50.79%（P<0.01）,藻纹苔酸为44.53%（P<0.01）,巴尔巴地衣酸为44.34%（P<0.01）。在13.75-55µmol/L浓度范围内,黑茶溃素ABTS·+自由基的清除率随着浓度的增大而逐渐增大,但量效关系并不明显。

表1 硬枝树花中6个化合物清除DPPH自由基能力

Table 1 DPPH scavenging activities of six compounds from thallus of Ramalina conduplicans

化合物
Compound 终浓度a和清除率
Final concertration (µmol/L) and clearance rate (%) 3.4375 6.875 13.75 27.5 55 BHT 43.43±0.82 48.45±0.16 65.46±1.95 69.40±1.67 77.36±0.62 (+)-松萝酸
(+)-usnic acid 49.65±0.94** 74.78±0.92** 67.18±0.24 74.82±0.67** 51.80±0.63** 地弗地衣酸
Diffractaic acid 42.69±0.64 49.26±0.95 48.81±0.52** 43.51±0.07** 58.38±0.77** 藻纹苔酸
Salazinic acid 44.92±0.38* 46.41±0.34 47.90±1.44** 50.50±0.28** 57.05±0.97** 黑茶溃素
Atranorin 36.27±0.38** 39.43±0.33** 37.90±0.37** 38.75±0.89** 39.19±0.32** 巴尔巴地衣酸
Barbatinic acid 39.98±0.15** 41.79±0.51** 41.21±1.09** 41.91±0.23** 50.50±1.06** 去甲环萝酸
Evernic acid 42.02±0.27** 48.59±1.43** 39.56±0.78** 40.88±0.18** 42.77±1.09** Note: a, compared with the same concertration of control group,*: P<0.05, **: P<0.01. The same below.注：a：终浓度为96孔板中每孔样品的最终浓度. 与同浓度对照组相比,*：P<0.05,**：P<0.01. 下表同. 表2 硬枝树花中6个化合物清除ABTS·+能力

Table 2 ABTS·+ scavenging activities of six compounds from thallus of Ramalina conduplicans

化合物
Compound 终浓度a和清除率
Final concertration (µmol/L) and clearance rate (%) 6.875 13.75 27.5 55 Trolox 47.70±0.19 58.21±1.45 70.11±0.18 81.81±0.34 (+)-松萝酸
(+)-usnic acid 52.38±1.56** 51.95±0.67** 53.51±0.73** 46.64±1.53** 地弗地衣酸
Diffractaic acid 44.94±1.72 45.97±0.57** 47.86±0.37** 50.79±1.13** 藻纹苔酸
Salazinic acid 43.08±1.05** 43.44±0.55** 43.63±0.81** 44.53±0.29** 黑茶溃素
Atranorin 49.98±0.91* 49.35±1.08** 51.57±0.13** 52.11±0.13** 巴尔巴地衣酸
Barbatinic acid 42.82±1.37** 43.26±0.40** 43.95±0.35** 44.34±0.50** 去甲环萝酸
Evernic acid 51.29±1.14** 49.68±1.65** 49.82±0.82** 49.60±0.04**

3 讨论

采用梯度提取法对硬枝树花进行梯度提取,并分离提纯单体化合物6个,结合核磁共振光谱及文献鉴定确定6个化合物为松萝酸、黑茶溃素、巴尔巴地衣酸、去甲环萝酸、地弗地衣酸、藻纹苔酸,均为首次从硬枝树花中得到。采用DPPH·和ABTS·+清除自由基的方法研究该6个化合物的抗氧化活性,既方便快捷,又灵敏可靠。6个化合物对DPPH·的清除效果较好,藻纹苔酸清除效果和摩尔浓度呈现一定的量效关系;在终浓度为3.4375µmol/L及27.5µmol/L时,松萝酸DPPH·清除率接近BHT 55µmol/L的清除率。ABTS·+的清除能力的研究表明,地弗地衣酸、藻纹苔酸、巴尔巴地衣酸随着浓度的增加,清除率增加,说明提取物剂量与清除率之间存在着一定的量效关系。

本研究的结果表明,硬枝树花的提取物有较好的清除自由基和抗氧化的能力,硬枝树花可食用,其含有多种极有潜力的天然抗氧化资源,有待进一步研究用于食品、药品及化妆品等相关产业,这是今后的研究重点。

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