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动物免疫学实验技术

来源：花匠小妙招时间：2024-11-02 00:20

PAGE · PAGE 1 · 第十九章玫瑰花环试验技术（Rosette formation test technique）一、E玫瑰花环试验基本原理玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E—玫瑰花环试验是T淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以粘附到T淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B淋巴细胞则没有红细胞受体，所以不能形成E—玫瑰花环，以资鉴别。（二）材料与试剂 1．肝素抗凝剂 2．淋巴细胞分层液配制方法见细胞分离技术。 3．无Ca2+、Mg2+ Hank’s液 NaCl 4.00g NaHCO3 0.175g KCl 0.20g Na2HPO4.12H2O 0.076g KH2PO4 0.030g 葡萄糖 0.50g H2O加至 500.00ml 用5.6％NaHCO3调pH至7.2，115℃15min灭菌。4℃贮藏备用。 4．5.6％NaHCO3液 NaHCO3 5.60g H2O 100.00ml 115℃20min灭菌, 4℃贮藏备用。 5．0.8％戊二醛溶液 25％戊二醛溶液 0.32ml Hank’s液 9.68ml 用前配制。 6．Giemsa—weight染色液 Giemsa粉 0.03g Weight粉 0.30g 甲醇 100.00ml 先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。（三）操作方法 1．取肝素抗凝血2ml，置37℃水浴自然沉淀30min～40min，吸取全部血浆（约1ml）。 2．于血浆中加Hank’s液数毫升，洗涤，1 500r/min离心5min～10min，弃上清。重复洗涤4次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。 3．采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hank’s液，洗涤3次，最后以Hank’s配成10％悬液，4℃保存。 4．取0.1ml淋巴细胞悬液，加10％红血球悬液0.1ml，加小牛血清0.1ml。 5．37℃水浴10min，低速离心（600r/min）5min。 6．吸弃多余的上清液后，放入4℃冰箱2h～4h。 7．取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8％戊二醛0.1ml，混匀后4℃固定15min。 8．将干净的玻片用Hank’s液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。 9．自然干燥后，用姬姆萨—瑞氏液（Giomsa—weight）或苏木精—伊红染色，水洗，干燥镜检。（四）结果判定凡一个淋巴细胞结合3个或3个以上的红细胞者为一个E—玫瑰环。检查200个淋巴细胞，按下列公式计算其玫瑰花环形成率。附：某些动物的E—玫瑰花环率马： 38.00±2.00％（29.01％～51.35％）（Tarr,M.J.） 31.20±9.64％（18.70％～51.29％）（成都军区军马防治检验所） 34.80±4.16％（豚鼠RBC）（哈兽研） 30.70±4.30％（绵羊RBC）（哈兽研） 36.53±12.09％（豚鼠RBC）（东北农业大学）骡： 27.50±5.46％（14％～38％）（成都军区军马防治检验所）驴： 32.90±3.60％（哈兽研） 42.90±3.78％（哈兽研）牛： 37.70±4.20％（Binns） 45.30±4.00％（James）绵羊：30.70±2.00％（Binns）山羊：13.30±1.20％