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生物胁迫耐性植物和方法与流程

来源：花匠小妙招时间：2024-10-14 13:05

生物胁迫耐性植物和方法与流程

1.本公开发明涉及到植物育种和基因育种领域，特别是涉及到提高植物的抗虫性。
2.发明背景
3.植物胁迫可以同时由生物的和非生物的因素引起。例如非生物胁迫包括，如可用水的过量或不足、极端温度和化学合成品如除草剂。生物胁迫的原因包括病原体感染、昆虫取食和槲寄生等其他植物的寄生。
4.虫害每年都会造成巨大的经济损失，无论是作物损失还是购买昂贵的杀虫剂来控制虫害。在过去的几个世纪里，控制这些害虫的主要方法是使用化学合成的杀虫化合物，然而化学化合物的广泛应用造成了许多环境问题。近几十年来生物技术的发展为通过基因工程控制害虫提供了机遇，特别是植物遗传学的发展，再加上昆虫生长因子和自然发生的植物防御化合物或因子的鉴定，为创造能够产生这些防御因子的转基因作物提供了机遇，从此保护植物免受昆虫攻击。
5.已知的芽孢杆菌属(bacillus)微生物的某些种对一系列昆虫害虫具有杀虫活性，这些昆虫包括鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、鞘翅目(coleoptera)、半翅目(hemiptera)害虫以及其他害虫。苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis，bt)和日本金龟子芽孢杆菌(bacillus popilliae)是至今为止发现的最成功的生物防治剂的代表。昆虫致病性也被认为是由幼虫芽孢杆菌(b.larvae)、缓病芽孢杆菌(b.lentimorbus)、球形芽孢杆菌(b.sphaericus)和蜡样芽孢杆菌(b.cereus)的菌株引起的。微生物杀昆虫剂，特别是那些从芽孢杆菌菌株获得的微生物杀昆虫剂，在农业上作为害虫化学防治的替代方案已起到重要的作用。
6.转基因作物现在广泛应用于农业，为农民提供了一种环境友好、商业上有吸引力的替代昆虫控制的传统方法。虽然这些转基因抗虫作物只能抵抗一小部分经济上重要的害虫。在某些情况下，昆虫会对不同的杀虫化合物产生抗药性，这就需要确定用于害虫控制的替代生物防治剂。因此，仍然需要具有不同杀虫活性范围的新型杀虫蛋白，包括但不限于对现有杀虫剂产生抗性的害虫，例如，对鳞翅目和鞘翅目多种昆虫具有活性的杀虫蛋白质。
7.因此，有必要开发提高植物对害虫耐受性的成分和方法。本发明提供了此类组合物和方法。
8.发明概述
9.以下实施例是本发明所涵盖的实施例之一：
10.在一个实施例中，本公开发明包括一个分离的多核苷酸，其编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。其中植物中所述多核苷酸表达的增加提高抗虫性。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸编码的氨基酸序列为seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24。在某些实施例中，所述分离的多核苷酸含有的核苷酸序列为seq id no:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22或23。
11.本公开发明还提供了一种重组dna构建体，所述重组dna构建体包含一个分离的多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列
与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。
12.本公开发明进一步提供了一种改良的植物或种子，所述改良的植物或种子具有至少一种编码多肽的多核苷酸的表达或活性的增加，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良的植物或种子在其基因组中含有一种重组dna构建体，所述重组dna构建体含有多核苷酸可操作地连接至少一个异源调控元件，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。在某些实施例中，所述改良的植物与对照植物相比较时表现出提高的抗虫性。
13.在某些实施例中，所述改良的植物或种子在基因组位点上包含有一个靶向基因修饰，所述靶向基因修饰的基因组位点含有的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。其中所述靶向基因修饰能增加所述多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述改良的植物与对照植物相比较时表现出提高的抗虫性。
14.在某些实施例中，所述抗虫性的增加对以下任一目的物种都不利：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、短翅目、同翅目、半翅目、正翅目、蝶翅目、皮翅目、等翅目、无翅目、虹吸翅目、毛翅目等，尤其是鳞翅目。在某些实施例中，所述昆虫害虫为亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)、水稻二化螟(chilo suppressalis)或东方粘虫(mythimna separata)。
15.在某些实施例中，所述植物来自于水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小麦、甘蔗和柳枝稷。
16.还提供了提高植物抗虫性的方法，所述方法包括提高至少一个编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。其中所述方法获得的植物与对照植物相比较时表现出增加的抗虫性。
17.在某些实施例中，所述提高植物抗虫性的方法包括：(a)向可再生的植物细胞引入一个含有可操作地连接有至少一个异源调控元件的多核苷酸的重组dna构建体，其中所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，其中所述植物在其基因组中含有所述重组dna构建体。
18.在某些实施例中，所述提高抗虫性方法包括：(a)向可再生的植物细胞的基因组位点引入一个含有多核苷酸的靶向基因修饰，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少80％的序列一致性；和(b)再生所述植物，其中所述植物在其基因组中含有引入的基因修饰，以及增加的多肽的表达和/或活性。在某些实施例中，所述靶向基因修饰使用以下基因修饰技术方法被引入：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于编码多肽的基因组位点的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非转录区；或(e)任意(a)-(d)的组合，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少80％的序列一致性。
19.附图说明及序列表
20.根据以下的发明详述和序列表，可更全面地理解本发明，以下的发明详述和序列表形成本技术的一部分。序列描述以及关联的序列表遵循如37c.f.r.
§§
1.821-1.825中所
列出的管理专利申请中的核苷酸和/或氨基酸序列公开的规则。序列表包含核苷酸序列字符的单字母码以及氨基酸的三字母码，格式遵循37c.f.r.
§§
1.821和1.825中列出的规则，并以引用的方式并入本文。
21.表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列的编号
[0022][0023]
发明详述
[0024]
本文中所列出的每篇参考文献的公开内容的全文均以引用的方式并入本文。
[0025]
如本文所用的并在所附权利要求书中的单数形式“一个”和“所述”包括复数涵义，除非上下文中清楚地另有指明。因此，例如，“一株植物”的涵义包括多株该类植物。“一个细胞”的涵义包括一个或多个细胞及其本领域的技术人员已知的等同物，等等。
[0026]
定义
[0027]
在本文中，植物“增加的抗虫性”是指与参考或对照植物相比，抑制一种或多种害虫生长、阻碍和/或杀死一种或多种害虫的植物，包括但不限于鳞翅目、双翅目、半翅目和鞘翅目昆虫。通常，当在其基因组中包含重组dna构建体或dna修饰的植物相对于参考或对照植物表现出更强的抗虫性时,参考或对照植物在其基因组中不包含重组dna构建体或dna修饰。
[0028]“害虫”包括但不限于昆虫、真菌、细菌、线虫类、螨、虱等。昆虫害虫包括选自以下各目的昆虫：鞘翅目(coleoptera)、双翅目(diptera)、膜翅目(hymenoptera)、鳞翅目(lepidoptera)、禽虱(mallophaga)、同翅目(homoptera)、半翅目(hemiptera)、直翅目(orthroptera)、缨尾目(thysanoptera)、革翅目(dermaptera)、等翅目(isoptera)、虱目(anoplura)、蚤目(siphonaptera)、毛翅目(trichoptera)等，特别是鳞翅目(lepidoptera)和鞘翅目(coleoptera)。
[0029]
本领域技术人员认识到，并非所有的复合物都能有效的对付所有害虫，本实施例的复合物能够对付昆虫害虫，这些害虫包括经济重要的农业、林业、温室、苗圃花卉、食品和纤维、公众和动物健康、家庭和商业结构、家庭和仓储害虫。
[0030]
鳞翅目(lepidoptera)的幼虫包括但不限于夜蛾科(noctuidae)的粘虫、切根虫、尺蠖和heliothines：秋粘虫(spodoptera frugiperda je smith，fall armyworm)；甜菜夜蛾(s.exigua h
ü
bner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(s.litura fabhcius，tobacco cutworm，cluster caterpillar)；蓓带夜蛾(mamestra configurata walker，bertha armyworm)；甘蓝夜蛾(m.brassicae linnaeus，cabbage moth)；黑切根虫(agrotis ipsilon hufnagel，black cutworm)；西部切根虫(a.orthogonia morrison，western cutworm)；颗粒夜蛾(a.subterranea fabricius，granulate cutworm)，木棉虫(alabama argillacea h
ü
bner，cotton leaf worm)；粉纹夜蛾(trichoplusia ni h
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bner，cabbage looper)；大豆夜蛾(pseudoplusia includens walker，soybean looper)；黧豆夜蛾(anticarsia gemmatalis h
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bner，velvetbean caterpillar)；苜蓿绿夜蛾(hypena scabra fabricius，greencloverworm)；烟芽夜蛾(heliothis virescens fabricius，tobacco budworm)；一星粘虫(pseudaletia unipuncta haworth,armyworm)；粗皮夜蛾(athetis mindara barnes and mcdunnough，rough skinned cutworm)；暗缘地老虎(euxoa messoria harris，darksided cutworm)；埃及金钢钻(earias insulana boisduval，spiny bollworm)；翠纹金钢钻(e.vittella fabricius，spotted bollworm)；美洲棉铃虫(helicoverpa armigera h
ü
bner，american bollworm)；谷实夜蛾(h.zea boddie，corn earworm或cotton bollworm)；纹蝶毛虫(melanchra picta harris，zebra caterpillar)；柑橘夜蛾(egira(xylomyges)curialis grote，citrus cutworm)；mythimna separate(oriental armyworm)；草螟科(crambidae)的钻蛀虫、鞘蛾幼虫、结网毛虫、球果蛾以及草蛾：亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis，asian corn borer)；欧洲玉米螟(ostrinia nubilalis，european corn borer)和；螟蛾科(pyralidae)欧洲玉米螟(ostrinia nubilalis h
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bner，european corn borer)的食叶虫(skeletonizers)；脐橙螟(amyelois transitella walker，naval orangeworm)；地中海粉斑螟(anagasta kuehniella zeller，mediterranean flour moth)；干果斑螟(cadra cautella walker，almond moth)；二化螟(chilo suppressalis walker，rice stem borer)；斑禾草螟(c.partellus，sorghum borer)；米蛾(corcyra cephalonicastainton，rice moth)；玉米根结网毛虫(crambus caliginosellus clemens，corn root webworm)；蓝草结网毛虫(c.teterrellus zincken，bluegrass webworm)；稻纵卷叶野螟(cnaphalocrocis medinalis guenee，rice leaf roller)；葡萄卷叶虫(desmia funeralis h
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bner，grape leaffolder)；甜瓜野螟(diaphania hyalinata linnaeus，melon worm)；泡菜虫(d.nitidalis stoll，pickleworm)；西南玉米螟(diatraea grandiosella dyar，southwestern corn borer)；小蔗螟(d.saccharalis fabricius，surgarcane borer)；墨西哥水稻螟(eoreuma loftini dyar，mexican rice borer)；烟草粉螟(ephestia elutella h
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bner，tobacco(cacao)moth)；蜡螟(galleria mellonella linnaeus，greater wax moth)；野螟(herpetogramma licarsisalis walker，sod webworm)；向日葵斑螟(homoeosoma electellum hulst，sunflower moth)；南美玉米苗斑螟(elasmopalpus lignosellus zeller，lesser cornstalk borer)；小蜡螟(achroia grisella fabricius，lesser wax moth)；草地螟(loxostege sticticalis linnaeus，beet webworm)；茶树螟(orthaga thyrisalis walker，tea tree web moth)；豆野螟(maruca testulalis geyer，bean pod borer)；印度
谷螟(plodia interpunctella h
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bner，indian meal moth)；三化螟(scirpophaga incertulas walker，yellow stem borer)；温室螟(udea rubigalis guenee，celery leaftier)；以及卷蛾科(tortricidae)的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫：黑头卷叶蛾(acleris gloverana walsingham，western blackheaded budworm)；黑头长翅卷蛾(a.variana fernald，eastern blackheaded budworm)；果树黄卷蛾(archips argyrospila walker，fruit tree leaf roller)；欧洲卷叶蛾(a.rosana linnaeus，european leaf roller)；以及其他的黄卷蛾属(archips)物种：棉褐带卷蛾(adoxophyes orana,fischer von summer fruit tortrix moth)；条纹向日葵螟(cochylis hospes walsingham，banded sunflower moth)；榛小卷蛾(cydia latiferreana walsingham，filbertworm)；苹果蠹蛾(c.pomonella linnaeus，coding moth)；杂色卷叶蛾(platynota flavedana clemens，variegated leafroller)；荷兰石竹小卷蛾(p.stultana walsingham，omnivorous leafroller)；欧洲葡萄小卷叶蛾(lobesia botrana denis&schifferm
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ller，european grape vine moth)；苹白小卷蛾(spilonota ocellana denis&schifferm
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ller，eyespotted bud moth)；萄果实蛀虫(endopiza viteana clemens，grape berry moth)；女贞细卷蛾(eupoecilia ambiguella h
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bner，vine moth)；巴西苹果卷叶蛾(bonagota salubricola meyrick，brazilian apple leafroller)；梨小食心虫(grapholita molesta busck，oriental fruit moth)；向日葵芽蛾(suleima helianthana riley，sunflower budmoth)；条卷蛾(argyrotaenia spp.)；尾蛱蝶(choristoneura spp.)。
[0031]
鳞翅目(lepidoptera)的所选其它农艺害虫包括但不限于：秋星尺蠖(alsophila pometaria harris，fall cankerworm)；桃枝麦蛾(anarsia lineatella zeller，peach twig borer)；犀额蛾(anisota senatoria j.e.smith，orange striped oakworm)；柞蚕(antheraea pernyi guerin-meneville，chinese oak tussah moth)；家蚕(bombyx mori linnaeus，silkworm)；棉潜蛾(bucculatrix thurberiella busck，cotton leaf perforator)；苜蓿黄蝶(colias eurytheme boisduval，alfalfa caterpillar)；胡桃黄蝶(datana integerrima grote&robinson，walnut caterpillar)；落叶松毛虫(dendrolimus sibiricus tschetwerikov，siberian silk moth)；白尺蠖(ennomos subsignaria h
ü
bner，elm spanworm)；菩提尺蠖(erannis tiliaria harris，linden looper)；黄毒蛾(euproctis chrysorrhoea linnaeus，browntail moth)；黑拟蛉蛾(harrisina americana guerin-meneville，grapeleaf skeletonizer)；范围毛虫飞蛾(hemileuca oliviae cockrell，range caterpillar)；美国白蛾(hyphantria cunea drury，fall webworm)；番茄蠹蛾(keiferia lycopersicella walsingham，tomato pinworm)；二尾蛱蝶(lambdina fiscellaria fiscellaria hulst，eastern hemlock looper)；西部铁杉尺蠖(l.fiscellaria lugubrosa hulst，western hemlock looper)；柳毒蛾(leucoma salicis linnaeus，satin moth)；舞毒蛾(lymantria dispar linnaeus，gypsy moth)；番茄天蛾(manduca quinquemaculata haworth，five spotted hawk moth，tomato hornworm)；烟草天蛾(m.sexta haworth，tomato hornworm，tobacco hornworm)；冬尺蠖(operophtera brumata linnaeus，winter moth)；春尺蠖(paleacrita vernata peck，spring cankerworm)；大凤蝶(papilio cresphontes cramer，giant swallowtail，orange dog)；
aphid，melon aphid)；玉米根蚜(a.maidiradicis forbes，corn root aphid)；苹果黄蚜(a.pomi de geer，apple aphid)；绣线菊蚜(a.spiraecola patch，spirea aphid)；茄沟无网蚜(aulacorthum solani kaltenbach，foxglove aphid)；草莓钉蚜(chaetosiphon fragaefolii cockerell，strawberry aphid)；麦双尾蚜(diuraphis noxia kurdjumov/mordvilko，russian wheat aphid)；玫瑰苹果蚜(dysaphis plantaginea paaserini，rosy apple aphid)；苹果绵蚜(eriosoma lanigerum hausmann，woolly apple aphid)；甘蓝蚜(brevicoryne brassicae linnaeus，cabbage aphid)；桃粉大尾蚜(hyalopterus pruni geoffroy，mealy plum aphid)；萝卜蚜(lipaphis erysimi kaltenbach，turnip aphid)；麦无网长管蚜(metopolophium dirrhodum walker，cereal aphid)；大戟长管蚜(macrosiphum euphorbiae thomas，potato aphid)；烟桃蚜(myzus persicae sulzer，peach-potato aphid，green peach aphid)；莴苣蚜(nasonovia ribisnigri mosley，lettuce aphid)；瘿绵蚜(pemphigus spp.，root aphids和gall aphids)；玉米蚜(rhopalosiphum maidis fitch，corn leaf aphid)；禾谷缢管蚜(r.padi linnaeus，bird cherry-oat aphid)；麦二叉蚜(schizaphis graminum rondani，greenbug)；黄色甘蔗蚜(sipha flava forbes，yellow sugarcane aphid)；麦长管蚜(sitobion avenae fabricius，english grain aphid)；苜蓿斑蚜(therioaphis maculata buckton,spotted alfalfa aphid)；黑色柑橘蚜(toxoptera aurantii boyer de fonscolombe,black citrus aphid)以及褐色桔蚜(t.citricida kirkaldy,brown citrus aphid)；球蚜(adelges spp.,adelgids)；长山核桃根瘤蚜(phylloxera devastatrix pergande,pecan phylloxera)；甘薯粉虱(bemisia tabaci gennadius,tobacco whitefly,sweetpotato whitefly)；银叶粉虱(b.argentifolii bellows&perring,silverleaf whitefly)；柑桔粉虱(dialeurodes citri ashmead,citrus whitefly)；烟粉虱(trialeurodes abutiloneus,bandedwinged whitefly)以及温室白粉虱(t.vaporariorum westwood,greenhouse whitefly)；马铃薯小绿叶蝉(empoasca fabae harris,potato leafhopper)；灰飞虱(laodelphax striatellus fallen,smaller brown planthopper)；紫菀叶蝉(macrolestes quadrilineatus forbes,aster leafhopper)；黑尾叶蝉(nephotettix cinticeps uhler,green leafhopper)；二条黑尾叶蝉(n.nigropictus stal,rice leafhopper)；褐飞虱(nilaparvata lugens stal,brown planthopper)；玉米飞虱(peregrinus maidis ashmead,corn planthopper)；白背飞虱(sogatella furcifera horvath,white-backed planthopper)；稻飞虱(sogatodes orizicola muir,rice delphacid)；苹果白叶蝉(typhlocyba pomaria mcatee,white apple leafhopper)；葡萄叶蝉(erythroneoura spp.,grape leafhoppers)；十七年蝉(magicicada septendecim linnaeus,periodical cicada)；吹绵蚧(icerya purchasi maskell,cottony cushion scale)；梨园盾蚧(quadraspidiotus perniciosus comstock,san jose scale)；柑桔臀纹粉蚧(planococcus citri risso,citrus mealybug)；粉蚧的种(pseudococcus spp.)(其他的粉蚧系群)；梨木虱(cacopsylla pyricola foerster,pear psylla)；柿木虱(trioza diospyri ashmead,persimmon psylla)。
[0036]
半翅目(hemiptera)中农艺上重要的物种包括但不限于：稻绿蝽(acrosternum hilare say,green stink bug)；南瓜缘蝽(anasa tristis de geer,squash bug)；麦长蝽
tick)；美洲壁虱(amblyomma americanum linnaeus,lone star tick)；以及痒螨科(psoroptidae)、蒲螨科(pyemotidae)和疥螨科(sarcoptidae)的痒螨和疥螨。
[0039]
缨尾目(thysanura)中的昆虫害虫是值得关注的，诸如西洋衣鱼(lepisma saccharina linnaeus,silverfish)；小灶衣鱼(thermobia domestica packard,firebrat)。
[0040]
所涵盖的其他节肢害虫包括蜘蛛目(araneae)中的蜘蛛，如棕色隐遁蜘蛛(loxosceles reclusa gertsch&mulaik,brown recluse spider)；和黑寡妇蜘蛛(latrodectus mactans fabricius,black widow spider)；和蚰蜒目(scutigeromorpha)的蜈蚣，如蚰蜒(scutigera coleoptrata linnaeus,house centipede)
[0041]
所关注的昆虫害虫包括蝽象总科和其他相关昆虫的总科，包括但不限于蝽象科(稻绿蝽(nezara viridula),茶翅蝽(halyomorpha halys),璧蝽(piezodorus guildini),褐臭蝽(euschistus servus),拟缘蝽(acrosternum hilare),大豆褐蝽(euschistus heros),euschistus tristigmus,dichelops furcatus,dichelops melacanthus,and菘蝽(bagrada hilaris))、龟蝽科(筛豆龟蝽-豆圆蝽(megacopta cribraria-bean plataspid)和土蝽科(根椿象(scaptocoris castanea-root stink bug))的物种；以及鳞翅目的物种，包括但不限于菜蛾(diamond-back moth)，如美洲棉铃虫(helicoverpa zea boddie)；大豆尺蠖(soybean looper)，如大豆夜蛾；以及黧豆毛虫(velvet bean caterpillar)，如黧豆夜蛾(anticarsia gemmatalis h
ü
bner)。
[0042]
线虫(nematodes)包括寄生性线虫，例如根结、胞囊和病变线虫，包括胞囊线虫属物种(heterodera spp.)、根结线虫属物种(meloidogyne spp.)和球异皮线虫属物种(globodera spp.)；特别是胞囊线虫的成员，包括但不限于，大豆胞囊线虫(heterodera glycines，soybean cyst nematode)；甜菜胞囊线虫(heterodera schachtii，beet cyst nematode)；禾谷胞囊线虫(heterodera avenae，cereal cyst nematode)以及马铃薯金线虫(globodera rostochiensis)和马铃薯白线虫(globodera pailida，potato cyst nematodes)。病变线虫包括短体线虫属物种(pratylenchus spp.)。
[0043]
用于测量杀虫活性的方法是本领域熟知的。参见例如，czapla and lang，(1990)j.econ.entomol.83：2480-2485；andrews等，(1988)biochem.j.252：199-206；marrone等，(1985)j.of economic entomology78：290-293以及美国专利号5743477，所有这些文献全文以引用方式并入本文。一般来讲，将蛋白混合并用于摄食测定。参见例如marrone等(1985)j.of economic entomology78：290-293。此类测定法可包括将植物与一种或多种害虫接触以及测定植物存活和/或促使害虫死亡的能力。
[0044]
如本文所用，“杀虫活性”是指生物体或物质(诸如，例如蛋白)的活性，不管生物体或物质是否有毒或抑制，其测量可以通过但不限于，害虫死亡率、害虫体重减少、害虫驱避性、害虫生长发育迟缓以及进食和暴露适当长时间后害虫的其它行为和物理变化。这种方式，杀虫药的活性影响至少一个与昆虫健康相关的测量参数。同样，“杀昆虫活性”是指害虫是昆虫时的“杀虫活性”。预期的“阻碍生长发育”是指按重量大于50％的生长抑制。例如，“杀虫蛋白”是自身显示或与其它蛋白组合显示杀虫活性的蛋白。监测杀昆虫活性的一般程序包括将试验性化合物或生物体添加到密封容器中的食物来源中。评价杀虫活性的试验是本领域熟知的。参见例如美国专利号6570005和6339144，文献全文以引用方式并入本文。所
关注的昆虫用于测试杀昆虫活性的最佳发育阶段是幼虫或不成熟的昆虫。昆虫可以在完全黑暗、20～30℃和30％～70％的相对湿度下饲养。生物测定可以根据czapla和lang(1990)j.econ.entomol.83(6)：2480-2485的描述进行操作。饲养昆虫幼虫的方法和生物测定的方法是本领域的普通技术人员熟知的。
[0045]
杀昆虫蛋白的毒性和抑制作用包括但不限于，与取食野生植物相比，取食转基因植物阻碍幼虫生长发育、杀死虫卵或者幼虫、减轻成虫或者幼虫的体重；诱导昆虫取食、筑巢或育种的回避行为。植物的抗昆虫性可以由将编码杀昆虫蛋白的核酸序列引入有机体或对有机体(如植物或植物的一部分)施用杀昆虫物质而赋予，其中杀昆虫物质包括但不限于杀昆虫蛋白。正如本文所用，“控制害虫群体”或“控制害虫”指对有害生物产生的进而限制其损害任何效应。控制害虫包括但不限于，杀死害虫、抑制害虫发育、改变害虫的育性或发育以致害虫对植物产生更小的损害、减少害虫产生后代的数量、产生发育不良的害虫、产生的害虫更容易受到捕食者攻击或阻止害虫取食植物。
[0046]“农艺性状”是一种可测参数，包括但不限于：绿色指数、籽粒产量、生长速率、生物累积速率或生物累积量、成熟期鲜重、成熟期干重、果实产量、种子产量、植株总含氮量、果实总含氮量、种子总含氮量、营养组织总含氮量、植株总游离氨基酸含量、果实游离氨基酸含量、种子游离氨基酸含量、营养组织总游离氨基酸含量、植株总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、营养组织蛋白含量、耐旱性、氮素吸收、根倒伏、收获指数、茎秆倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、籽粒大小、早苗活力和低温胁迫下的出苗率。
[0047]“转基因”指其基因组因异源核酸(如重组dna构建体)的存在而发生改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初的转基因事件以及从最初的转基因事件通过有性杂交或无性生殖而产生的那些。如本文所用的术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)改变。
[0048]“对照”、“对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因。例如，对照植物可以与受测植物有着相同基因背景，但不含有产生受测植物或细胞的基因改变。
[0049]“植物”包括整个植株、植物器官、植物组织、种子和植物细胞以及同一植株的子代。植物细胞包括但不限于得自下列物质的细胞：种子、悬浮培养物、胚、分生区域、愈伤组织、叶、根、芽、配子体、孢子体、花粉和小孢子。
[0050]“子代”包括植物的任何后续世代。
[0051]“修饰植物”包括在其基因组内包含异源多核苷酸或修饰的基因或启动子的植物。异源多核苷酸能够稳定地整合进基因组中，并遗传连续的世代。异源多核苷酸可单独地或作为重组dna构建体的部分整合进基因组中。t0植物直接源于转化和再生过程，t0植物的子代为t1代(第一个子代)，t2代(第二个子代)等。修饰的基因或启动子可以是植物基因组中单个或几个或一段脱氧核苷酸的插入或删除。
[0052]
针对序列而言的“异源”意指来自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则指通过蓄意的人为干预而从其天然形式发生了组成和/或基因座的显著改变的序列。
[0053]“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”或“核酸片段”可互换使用并且是任选含有合成的、非天然的或改变的核苷酸碱基的单链或双链rna或dna聚合物。核苷酸(通常以5′‑
单磷酸形式存在)通过如下它们的单个字母名称来指代：“a”为腺苷酸或脱氧腺苷酸(分别对应rna或dna)，“c”表示胞苷酸或脱氧胞苷酸，“g”表示鸟苷酸或脱氧鸟苷酸，“u”表示尿苷酸，“t”表示脱氧胸苷酸，“r”表示嘌呤(a或g)，“y”表示嘧啶(c或t)，“k”表示g或t，“h”表示a或c或t，“i”表示肌苷，并且“n”表示任何核苷酸。
[0054]“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。术语“多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”还可包括修饰形式，包括但不限于糖基化、脂质连接、硫酸盐化、谷氨酸残基的γ羧化、羟化和adp-核糖基化。
[0055]“重组dna构建体”指在自然界中通常不会一起存在的核酸片段的组合。因此，重组dna构建体可包含不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源但以不同于通常天然存在的方式排列的调控序列和编码序列。.
[0056]“调控序列”和“调控元件”是指位于编码序列的上游(5
′
非编码序列)、中间或下游(3
′
非编码序列)，并且影响相关编码序列的转录、rna加工或稳定性或者翻译的核苷酸序列。调控序列可包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。“调控序列”和“调控元件”可互换使用
[0057]“启动子”指能够控制另一核酸片段转录的核酸片段。“植物中有功能的启动子”是能够控制植物细胞中的转录的启动子，无论其是否来源于植物细胞。“组织特异性启动子”和“组织优选启动子”可互换使用，并且指主要但非必须专一地在一种组织或器官中表达，也可在一种特定细胞中表达的启动子。“发育调控启动子”指其活性由发育事件决定的启动子。
[0058]
术语“可操作地连接”指核酸片段连接成单一片段，使得其中一个核酸片段的功能受到另一个核酸片段的调控。例如，在启动子能够调节核酸片段的转录时，该启动子与该核酸片段进行了可操作地连接。
[0059]“表达”指功能产物的产生。例如，核酸片段的表达可指核酸片段的转录(如转录生成mrna或功能rna)和/或rna翻译成前体或成熟蛋白质。
[0060]
在本文中“增加”、“提高”等是指与对照组(例如，不包含dna修饰的野生型植物)相比，实验组(例如，具有本文所述dna修饰的植物)中任何可检测到的增加。因此，蛋白质的增加表达包括样品中蛋白质总水平的任何可检测的增加，并且可以使用本领域的常规方法(例如，western blotting和elisa)来确定。
[0061]
在本文中，在两个多核苷酸或多肽序列的背景下，“序列一致性”或“一致性”是指在指定的比较窗口内比对以获得最大对应性时相同的两个序列中的残基。当序列同一性百分比用于蛋白质时，人们认识到不完全相同的残基位置往往因保守的氨基酸替代而有所不同，其中氨基酸残基被其他具有相似化学性质(如电荷或疏水性)的氨基酸残基所取代因此不会改变分子的功能特性。当序列在保守取代中不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过这种保守取代而不同的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调整的手段对于本领域技术人员来说是众所周知的。通常，这涉及将保守取代评分为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，在相同氨基酸的得分为1且非保守取代的得分为零的情况下，保守取代的得分为零至1。例如，如在程
no:12)由水稻基因组位点loc_os06g38450.1处的编码序列(cds)(seq id no:11)或核苷酸序列(seq id no:10)编码，在tigr中注释为“vignain前体，推测，表达”，在ncbi中注释为“ervatamin-b”。“erv-b多肽”在本文中是指oserv-b多肽及其来自其他生物体的同源物和同系物。
[0072]“osbhlh065”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予抗虫表型。osbhlh065多肽(seq id no:15)由水稻基因组位点loc_os04g41570.2处的编码序列(cds)(seq id no:14)或核苷酸序列(seq id no:13)编码，在tigr中被注释为“乙烯反应蛋白相关，推测，表达”，在ncbi中被注释为“转录因子bhlh153”。“bhlh065多肽”在本文中是指osbhlh065多肽及其来自其他生物体的同源物和同系物。
[0073]“osgrp1”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予抗虫表型。osgrp1多肽(seq id no:18)由水稻基因座loc_os04g41580.1处的编码序列(cds)(seq id no:17)或核苷酸序列(seq id no:16)编码，其在tigr中被注释为“富含甘氨酸的蛋白质，推测，表达”。“grp1多肽”在本文中指osgrp1多肽及其来自其他生物体的同源物和同系物。
[0074]“osap2-4”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予抗虫表型。osap2-4多肽(seq id no:21)由水稻基因座loc_os04g46440.1处的编码序列(cds)(seq id no:20)或核苷酸序列(seq id no:19)编码，在tigr中被注释为“ap2结构域包含蛋白质，表达”。“ap2-4多肽”在本文中是指osap2-4多肽及其来自其他生物体的同源物和同系物。
[0075]“osduf630/duf632”是指一种水稻多肽，在过量表达时赋予抗虫表型。osduf630/duf632多肽(seq id no:24)由水稻基因座loc_os02g07850.1处的编码序列(cds)(seq id no:23)或核苷酸序列(seq id no:22)编码，在tigr中被注释为“含有蛋白质的假定表达的duf630/duf632结构域”。“duf630/duf632多肽”在本文中是指osduf630/duf632多肽及其来自其他生物体的同源物和同系物。
[0076]
本文所用“杀虫蛋白”指一种对一种或多种害虫有毒害作用的多肽或其同源蛋白，所述害虫包括但不限于，鳞翅目(lepidoptera)、双翅目(diptera)、半翅目(hemiptera)和鞘翅目(coleoptera)成员或线虫动物门(nematoda phylum)。杀虫蛋白分离自有机体包括，例如，芽孢杆菌属(bacillus sp.)、假单胞菌属(pseudomonas sp.)、发光杆菌属(photorhabdus sp.)、致病杆菌属(xenorhabdus sp.)双酶杆菌属(clostridium bifermentans)和日本金龟子芽孢杆菌属(paenibacillus popilliae)。杀虫蛋白包括但不限于来源于假单胞菌属(pseudomonas sp.)的杀虫蛋白，如pseen3174(monalysin；(2011)plos pathogens 7：1-13)、源于假单胞菌属(pseudomonas protegens)的菌株cha0和pf-5(previously fluorescens)的杀虫蛋白(pechy-tarr，(2008)environmental microbiology 10：2368-2386；genbank登录号eu400157)、源于黄山假单胞菌(pseudomonas taiwanensis)的杀虫蛋白(liu等(2010)j.agric.food chem.,58：12343-12349)和源于假单胞产碱菌属(pseudomonas pseudoalcligenes)的杀虫蛋白(zhang等(2009)annals of microbiology 59：45-50and li等(2007)plant cell tiss.organ cult.89：159-168)；来源于发光杆菌属(photorhabdus sp.)和致病杆菌(xenorhabdus sp.)的杀虫蛋白(hinchliffe等(2010)the open toxicology journal,3：101-118and morgan,等(2001)applied and envir.micro.67：2062-2069)；美国专利号6048838和美国专利号6379946，美国公开号us2014/008054的pip-1多肽，美国系列号13/800233的afip-1a和/或afip-1b多
肽，美国系列号13/839702的phi-4多肽和δ-内毒素。所述δ-内毒素包括但不限于，δ-内毒素基因的cry1、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10、cry11、cry12、cry13、cry14、cry15、cry16、cry17、cry18、cry19、cry20、cry21、cry22、cry23、cry24、cry25、cry26、cry27、cry 28、cry 29、cry 30、cry31、cry32、cry33、cry34、cry35、cry36、cry37、cry38、cry39、cry40、cry41、cry42、cry43、cry44、cry45、cry 46、cry47、cry49、cry 51、cry55、cry56、cry57、cry58、cry59、cry60、cry61、cry62、cry63、cry64、cry65、cry66、cry67、cry68、cry69、cry70、cry71和cry72类，和苏云金芽孢杆菌(b.thuringiensis)细胞溶解的cyt1和cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀虫蛋白的成员包括，但不限于cry1aa1(登录号aaa22353)、cry1aa2(登录号aaa22552)、cry1aa3(登录号baa00257)、cry1aa4(登录号caa31886)、cry1aa5(登录号baa04468)、cry1aa6(登录号aaa86265)、cry1aa7(登录号aad46139)、cry1aa8(登录号i26149)、cry1aa9(登录号baa77213)、cry1aa10(登录号aad55382)、cry1aa11(登录号caa70856)、cry1aa12(登录号aap80146)、cry1aa13(登录号aam44305)、cry1aa14(登录号aap40639)、cry1aa15(登录号aay66993)、cry1aa16(登录号hq439776)、cry1aa17(登录号hq439788)、cry1aa18(登录号hq439790)、cry1aa19(登录号hq685121)、cry1aa20(登录号jf340156)、cry1aa21(登录号jn651496)、cry1aa22(登录号kc158223)、cry1ab1(登录号aaa22330)、cry1ab2(登录号aaa22613)、cry1ab3(登录号aaa22561)、cry1ab4(登录号baa00071)、cry1ab5(登录号caa28405)、cry1ab6(登录号aaa22420)、cry1ab7(登录号caa31620)、cry1ab8(登录号aaa22551)、cry1ab9(登录号caa38701)、cry1ab10(登录号a29125)、cry1ab11(登录号i12419)、cry1ab12(登录号aac64003)、cry1ab13(登录号aan76494)、cry1ab14(登录号aag16877)、cry1ab15(登录号aao13302)、cry1ab16(登录号aak55546)、cry1ab17(登录号aat46415)、cry1ab18(登录号aaq88259)、cry1ab19(登录号aaw31761)、cry1ab20(登录号abb72460)、cry1ab21(登录号abs18384)、cry1ab22(登录号abw87320)、cry1ab23(登录号hq439777)、cry1ab24(登录号hq439778)、cry1ab25(登录号hq685122)、cry1ab26(登录号hq847729)、cry1ab27(登录号jn135249)、cry1ab28(登录号jn135250)、cry1ab29(登录号jn135251)、cry1ab30(登录号jn135252)、cry1ab31(登录号jn135253)、cry1ab32(登录号jn135254)、cry1ab33(登录号aas93798)、cry1ab34(登录号kc156668)、cry1ab-like(登录号aak14336)、cry1ab-like(登录号aak14337)、cry1ab-like(登录号aak14338)、cry1ab-like(登录号abg88858)、cry1ac1(登录号aaa22331)、cry1ac2(登录号aaa22338)、cry1ac3(登录号caa38098)、cry1ac4(登录号aaa73077)、cry1ac5(登录号aaa22339)、cry1ac6(登录号aaa86266)、cry1ac7(登录号aab46989)、cry1ac8(登录号aac44841)、cry1ac9(登录号aab49768)、cry1ac10(登录号caa05505)、cry1ac11(登录号caa10270)、cry1ac12(登录号i12418)、cry1ac13(登录号aad38701)、cry1ac14(登录号aaq06607)、cry1ac15(登录号aan07788)、cry1ac16(登录号aau87037)、cry1ac17(登录号aax18704)、cry1ac18(登录号aay88347)、cry1ac19(登录号abd37053)、cry1ac20(登录号abb89046)、cry1ac21(登录号aay66992)、cry1ac22(登录号abz01836)、cry1ac23(登录号caq30431)、cry1ac24(登录号abl01535)、cry1ac25(登录号fj513324)、cry1ac26(登录号fj617446)、cry1ac27(登录号fj617447)、cry1ac28(登录号acm90319)、cry1ac29(登录号dq438941)、cry1ac30(登录号gq227507)、cry1ac31(登录号gu446674)、cry1ac32(登录号hm061081)、cry1ac33(登录号gq866913)、cry1ac34(登录号
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[0077]
δ-内毒素的例子包括但不限于美国专利号中5880275和7858849中cry1a蛋白，美国专利号8304604、8304605和8476226中dig-3或dig-11毒素(n-端删除的α-helix 1和/或α-helix 2变体cry蛋白，例如cry1a、cry3a)，美国专利申请系列号：10/525318cry1b，us专利号6033874cry1c，美国专利号5188960和6218188的cry1f，美国专利号7070982、6962705和6713063cry1a/f嵌合体chimeras；cry2蛋白诸如美国专利号7064249中cry2ab蛋白；cry3a蛋白包括但不限于至少两种不同cry蛋白的可变区和保守区融合独特的组合产生的基因工程杂交杀虫蛋白(ehip)(美国专利申请公开号2010/0017914)；cry4蛋白；cry5蛋白；cry6蛋白；美国专利号7329736、7449552、7803943、7476781、7105332、7378499和7462760的cry8蛋白；cry9蛋白例如cry9a、cry9b、cry9c、cry9d、cry9e和cry9f家族成员；cry15蛋白(naimov等2008applied and environmental microbiology 74:7145-7151)；美国专利号6127180、6624145和6340593中的cry22和cry34ab1蛋白；美国专利号6248535、6326351、6399330、6949626、7385107和7504229中cryet33和cryet34蛋白；美国专利公开号2006/0191034、2012/0278954和pct公开号wo 2012/139004中cryet33和cryet34同源物；美国专利号6083499、6548291和6340593中cry35ab1蛋白；cry46蛋白、cry 51蛋白、cry二元毒素、tic901或相关毒素；美国专利申请公开号2008/0295207中tic807；pct申请us 2006/033867中et29、et37、tic809、tic810、tic812、tic127、tic128；美国专利号8236757中axmi-027、axmi-036和axmi-038；美国专利号7923602中axmi-031、axmi-039、axmi-040、axmi-049；wo2006/083891中axmi-018、axmi-020和axmi-021；wo 2005/038032中axmi-010；wo 2005/021585中axmi-003；美国专利申请公开号2004/0250311中axmi-008；美国专利申请公开号2004/0216186中axmi-006；美国专利申请公开号2004/0210965中axmi-007；美国专利申请号2004/0210964中axmi-009；美国专利申请公开号2004/0197917中axmi-014；美国专利申请公开号2004/0197916中axmi-004；wo 2006/119457中axmi-028和axmi-029；wo2004/074462中axmi-007、axmi-008、axmi-0080rf2、axmi-009、axmi-014和axmi-004；us专利号8,084,416中axmi-150；美国专利申请公开号2011/0023184中axmi-205；美国专利申请公开号2011/0263488中axmi-011、axmi-012、axmi-013、axmi-015、axmi-019、axmi-044、axmi-037、axmi-043、axmi-033、axmi-034、axmi-022、axmi-023、axmi-041、axmi-063和axmi-064；美国
专利申请公开号2010/0197592中axmi-r1和相关蛋白；wo2011/103248中axmi221z、axmi222z、axmi223z、axmi224z和axmi225z；wo 2011/103247中axmi218、axmi219、axmi220、axmi226、axmi227、axmi228、axmi229、axmi230和axmi231；美国专利号8334431中axmi-115、axmi-113、axmi-005、axmi-163和axmi-184；美国专利申请公开号2010/0298211中axmi-001、axmi-002、axmi-030、axmi-035和axmi-045；美国专利申请公开号2009/0144852中axmi-066和axmi-076；美国专利号8318900中axmi128、axmi130、axmi131、axmi133、axmi140、axmi141、axmi142、axmi143、axmi144、axmi146、axmi148、axmi149、axmi152、axmi153、axmi154、axmi155、axmi156、axmi157、axmi158、axmi162、axmi165、axmi166、axmi167、axmi168、axmi169、axmi170、axmi171、axmi172、axmi173、axmi174、axmi175、axmi176、axmi177、axmi178、axmi179、axmi180、axmi181、axmi182、axmi185、axmi186、axmi187、axmi188、axmi189；美国专利申请公开号2010/0005543中axmi079、axmi080、axmi081、axmi082、axmi091、axmi092、axmi096、axmi097、axmi098、axmi099、axmi100、axmi101、axmi102、axmi103、axmi104、axmi107、axmi108、axmi109、axmi110、axmi111、axmi112、axmi114、axmi116、axmi117、axmi118、axmi119、axmi120、axmi121、axmi122、axmi123、axmi124、axmi1257、axmi1268、axmi127、axmi129、axmi164、axmi151、axmi161、axmi183、axmi132、axmi138、axmi137；美国专利申请公开号201400962281中axmi232、axmi233和axmi249；美国专利号8319019中cry蛋白例如具有修饰蛋白水解位点的cry1a和cry3a；美国专利申请公开号2011/0064710中源于苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)菌株vbts 2528的cry1ac、cry2aa和cry1ca毒素蛋白。本领域技术人员熟知的其他cry蛋白(见crickmore等“苏云金芽孢杆菌(bacillus thuringiensis)毒素系统命名法”(2011),at www.lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/)。本领域技术人员熟知cry蛋白的杀虫活性(详见综述，van frannkenhuyzen,(2009)j.invert.path.101:1-16)。本领域技术人员熟知cry蛋白作为转基因植物性状，cry-转基因植物已经得到调控许可，这些转基因植物包括但不限于表达cry1ac、cry1ac+cry2ab、cry1ab、cry1a.105、cry1f、cry1fa2、cry1f+cry1ac、cry2ab、cry3a、mcry3a、cry3bb1、cry34ab1、cry35ab1、vip3a、cry9c和cbi-bt的植物(详见sanahuja,(2011)plant biotech journal 9:283-300和转基因作物数据库中心的环境风险评估gm crop database center for environmental risk assessment(2010)(cera),ilsi研究基金会,华盛顿特区www.cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database)。本领域技术人员熟知的在植物中表达的杀虫蛋白包括，例如vip3ab&cry1fa(us2012/0317682)，cry1be&cry1f(us2012/0311746)，cry1ca&cry1ab(us2012/0311745)，cry1&cryca(us2012/0317681)，cry1da&cry1be(us2012/0331590)，cry1da&cry1fa(us2012/0331589)，cry1ab&cry1be(us2012/0324606)，cry1fa&cry2aa和cry1i&cry1e(us2012/0324605)，cry34ab/35ab和cry6aa(us20130167269)，cry34ab/vcry35ab&cry3aa(us20130167268)，和cry3a和cry1ab或vip3aa(us20130116170)。杀虫蛋白也包括杀虫脂肪酶，其包括美国专利号7,491,869的脂酰基水解酶,和诸如源于链霉菌的胆固醇氧化酶(purcell等(1993)biochem biophys res commun 15：1406-1413)。杀虫蛋白也包括美国专利号5877012、6107279、6137033、7244820、7615686、8237020等的vip(vegetative insecticidal protein，植物杀虫蛋白)毒素。本领域技术人员熟知的其他vip蛋白见lifesci.sussex.ac.uk/home/neil_crickmore/bt/
vip.html。杀虫蛋白也包括源于嗜线虫致病杆菌属(xenorhabdus)、初生型发光杆菌属(photorhabdus)和类芽孢杆菌(paenibacillus)的毒素复合物(toxin complex(tc))(见美国专利号7491698和8084418)。一些tc蛋白具有“独立”的杀昆虫活性，其他tc蛋白增强了同一给定有机体产生的独立tc蛋白的活性，“独立”tc蛋白的活性(例如，源于发光杆菌、致病杆菌或芽孢杆菌)能够被一种或多种来源不同种属有机体tc蛋白“增强剂”所增强。主要有三种类型tc蛋白，此处所指的是类型a蛋白(“蛋白质a”)是单体毒素。类型b蛋白(“蛋白质b”)和类型c蛋白(“蛋白质c”)增强类型a蛋白的毒性。类型a蛋白的例子有tcba、tcda、xpta1和xpta2，类型b蛋白的例子有tcac、tcdb、xptb1xb和xptc1wi，类型c蛋白的例子有tccc、xptc1xb和xptb1wi。杀虫蛋白也包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的例子包括但不限于lycotoxin-1肽及其突变体(美国专利号8334366)。
[0078]
应理解，如本领域技术人员将理解的，本发明包含的不仅仅是具体的示例性序列。核酸片段的改变导致在给定位点产生化学等效氨基酸，但不影响编码多肽的功能性质，这在本领域是众所周知的。例如，氨基酸丙氨酸(疏水性氨基酸)的密码子可由编码另一疏水性较小的残基(例如甘氨酸)或疏水性较大的残基(例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸)的密码子取代。类似地，导致一个带负电的残基替换另一个残基的变化，如用天冬氨酸替换谷氨酸，或一个带正电的残基替换另一个残基，如用赖氨酸替换精氨酸，也可预期产生功能等效的产物。导致多肽分子n端和c端部分改变的核苷酸变化也不会改变多肽的活性。所提议的每一个修改都在本领域的常规技术范围内，如同确定编码产品的生物活性保留一样。
[0079]
重组dna构建体
[0080]
还提供包含本文所述任何多核苷酸的重组dna构建体。在某些实施例中，重组dna构建体进一步包含至少一个调控元件。在某些实施例中，至少一个调节元件是异源调控元件。在某些实施例中，重组dna构建体的至少一个调控元件包含启动子。在某些实施例中，所述启动子是一个异源启动子。
[0081]
许多启动子可用于本发明的重组dna构建体中。启动子可以基于期望的结果来选择，并且可以包括组成型、组织特异性、诱导型或其他在宿主生物体中表达的启动子。
[0082]“组成型”启动子是一种在大多数环境条件下都具有活性的启动子。组成型启动子包括，例如，rsyn7启动子的核心启动子和在wo 99/43838和美国专利号6072050中公开的其他组成型启动子；核心camv 35s启动子(odell等(1985)nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(mcelroy等人(1990)植物细胞2:163-171)；泛素(christensen等(1989)plant mol.biol.12:619-632和christensen等(1992)plant mol.biol.18:675-689)；pemu(last等(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；mas(velten等(1984)embo j.3:2723-2730)；als启动子(美国专利号5659026)等。其他组成型启动子包括，例如，美国专利号5608149；5608144；5604121；5569597；5466785；5399680；5268463；5608142和6177611。
[0083]
组织特异性或发育调节启动子是一种dna序列，它选择性地调节植物细胞/组织中dna序列的表达，例如在那些对雄穗发育、结实或两者都至关重要的细胞/组织中，这通常将这种dna序列的表达限制在植物所需的发育时期(例如雄穗发育或种子成熟)。可在本发明的方法中使用引起所需时间和空间表达的任何可识别的启动子。
[0084]
本领域已知许多叶片首选启动子(yamamoto等(1997)plant j.12(2)：255-265；kwon等(1994)plant physiol.105:357-367；yamamoto等(1994)plant cell physiol.35
(5)：773-778；gotor等(1993)plant j.3:509-518；orozco等(1993)plant mol.biol.23(6)：1129-1138；matsuoka等(1993)《美国自然科学院学报》90(20)：9586-9590)。
[0085]
具有种子或胚胎特异性且对本发明中有用的启动子包括：大豆kunitz胰蛋白酶抑制剂(kti3、jofuku和goldberg.(1989)植物细胞1:1079-1093)、康维西林、维西林和豆科蛋白(豌豆子叶)(rerie，w.g.等(1991)mol.genet.259:149-157；newbigin，e.j.等(1990)planta 180:461-470；higgins，t.j.v.等(1988)plant.mol.biol.11:683-695)、玉米醇溶蛋白(玉米胚乳)(schemthaner，j.p.等(1988)embo j.7:1249-1255)、菜豆素(豆子叶)(segupta gopalan，c.等(1985)proc.natl.acad.sci.82:3320-3324)、植物血凝素(豆子叶)(voelker，t等(1987)embo.6:3571-3577)，b-伴大豆蛋白和大豆蛋白(大豆子叶)(chen，z-l等(1988)embo j.7:297-302)、谷蛋白(水稻胚乳)、醇溶蛋白(大麦胚乳)(marris，c.等(1988)植物分子生物学10:359-366)、谷蛋白和醇溶蛋白(小麦胚乳)(colot，v.等(1987)embo j.6:3559-3564)。与嵌合基因结构中异源编码区可操作连接的种子特异基因的启动子在转基因植物中保持其时空表达模式。这些例子包括在拟南芥和甘蓝型油菜种子中表达脑啡肽的拟南芥2s种子贮藏蛋白基因启动子(vanderkerckhove等(1989)bio/technology 7:l929-932)、表达荧光素酶的大豆凝集素和大豆β-豆素启动子(riggs等(1989)plant sci.63:47-57)，和小麦谷蛋白启动子表达氯霉素乙酰转移酶(colot等人(1987)embo j 6:3559-3564)。
[0086]
可诱导启动子选择性表达可操作连接的dna序列，以响应内源性或外源性刺激的存在，例如通过化合物(化学诱导剂)或响应环境、激素、化学和/或发育信号。可诱导或调节的启动子包括，例如，受光、热、应激、洪水或干旱、植物激素、创伤或诸如乙醇、茉莉酸、水杨酸或安全剂等化学物质调控的启动子。
[0087]
还可以考虑合成启动子，其包括一个或多个异源调节元件的组合。
[0088]
本发明的重组dna构建体的启动子可以是本领域已知的任何类型或类别的启动子，从而可以使用多个启动子中的任何一个来表达本文公开的各种多核苷酸序列，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。可基于期望结果选择用于本发明重组dna构建体中的启动子。
[0089]
本发明的重组dna构建体还可包括其他调控元件，包括但不限于翻译先导序列、内含子和聚腺苷酸化识别序列。在某些实施例中，重组dna构建体进一步包含增强子或沉默子。
[0090]
内含子序列可添加到5'非翻译区、蛋白质编码区或3'非翻译区，以增加积累在胞浆中的成熟信息量。在植物和动物表达结构的转录单元中加入可剪接的内含子已被证明在mrna和蛋白质水平上能增加基因表达高达1000倍(buchman和berg.(1988)mol.cell biol.8:4395-4405；callis等人(1987)genes dev.1:1183-1200)。
[0091]
植物和植物细胞
[0092]
提供了在基因组中含有任何本文所述的重组dna构建体的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒。
[0093]
还提供了在基因组位点含有引入的基因修饰的植物、植物细胞、植物部分、种子和籽粒，所述引入的基因修饰编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24这些序列有至少80％的一致性。在某些实施例中，所述基因修饰增加编码多肽的水平。在
某些实施例中，所述基因修饰同时增加编码多肽的水平和活性。
[0094]
所述植物可以是一个双子叶或单子叶植物，比如，水稻或玉米或大豆植物，例如玉米自交植株或玉米杂交植物。所述植物还可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗或柳枝稷。
[0095]
在某些实施例中，所述植物与对照植物相比较时表现出增加的抗虫性。
[0096]
其它目的性状的堆叠
[0097]
在某些实施例中，本公开发明的多核苷酸被设计成分子堆叠。因此，本文公开的各种宿主细胞、植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒可进一步包括一个或多个目的性状。在某些实施例中，目的多核苷酸在宿主细胞、植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒中以任意组合的方式进行堆叠，以便产生具有所需性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”是指在所需的同一植物或生物体中存在多个性状。例如，“堆叠性状”可以包括一个分子堆叠，其中序列在物理上彼此相邻。本文所用的性状是指从特定序列或序列组衍生的表型。在一个实施例中，分子堆叠包含至少一个能赋予草甘膦耐受性的多核苷酸。能赋予草甘膦耐受性的多核苷酸在本领域已知的。
[0098]
在某些实施例中，分子堆叠包含至少一个对草甘膦产生耐受性的多核苷酸和至少一个对第二种除草剂产生耐受性的附加多核苷酸。
[0099]
具有本发明多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或谷物也可与至少一种其他性状组合，以产生进一步包含各种期望性状组合的植物。例如，具有本发明多核苷酸序列的植物、植物细胞、植物部分、种子和/或籽粒可与编码具有杀虫和/或杀虫活性的多肽的多核苷酸或植物、植物细胞、植物部分、种子堆叠，和/或具有本发明多核苷酸序列的籽粒可与植物抗病基因结合。
[0100]
转基因植物可包含本文公开的一个或多个杀虫或抗虫多核苷酸与一个或多个附加多核苷酸的堆叠，从而产生或抑制多个多肽序列。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法和/或通过基因工程方法获得。这些方法包括但不限于培育包含目标多核苷酸的单个株系，将包含本文所公开基因的转基因植物转化为后续基因，并将基因共转化为单个植物细胞。在本文中，术语“堆叠”包括在同一植物中存在多个性状(即，两个性状并入核基因组，一个性状并入核基因组，一个性状并入质体基因组，或者两个性状并入质体基因组)。在一个非限制性示例中，“堆叠性状”包括一个分子堆栈，其序列在物理上彼此相邻。本文所用的性状是指从特定序列或序列组衍生的表型。可以使用包含多个基因的单个转化载体或在多个载体上单独携带的基因来进行基因的共转化。如果序列是通过对植物进行遗传转化而堆积起来的，那么目标多核苷酸序列可以在任何时间以任何顺序进行组合。这些性状可以在共转化方案中与任何转化盒组合提供的相关多核苷酸同时引入。例如，如果将引入两个序列，则这两个序列可以包含在单独的转换盒(trans)中或包含在相同的转换盒(cis)中。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入将抑制所需多核苷酸表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过量表达盒的任何组合结合，以产生植物中所需的性状组合。进一步认识到，多核苷酸序列可以使用位点特异性重组系统堆叠在所需的基因组位置。例如，参见wo 1999/25821、wo 1999/25854、wo1999/25840、wo 1999/25855和wo 1999/25853，所有这些均通过引用并入本文。
[0101]
方法：
[0102]
提供了一种提高植物抗虫性的方法，植物中含有至少一种编码多肽的多核苷酸表达的增加，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少80％(即，80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的序列一致性。
[0103]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)表达可再生植物细胞的重组dna构建体，所述重组dna构建体含有一个调控元件可操作地连接编码多肽的多核苷酸；和(b)再生所述植物，其中在植物基因组中包含有重组dna构建体。在某些实施例中，所述调控元件是一个异源启动子。
[0104]
在某些实施例中，所述方法包括：(a)向可再生植物细胞的基因组位点引入一个靶向基因修饰以编码所述多肽；和(b)再生所述植物，其中植物中编码多肽的水平和/活性是增加的。在某些实施例中，所述靶向基因修饰的引入使用了以下基因修饰技术：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程位点特异性巨核酸酶或argonaute。在某些实施例中，所述靶向基因修饰存在于基因组位点的：(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；或(e)任何(a)-(d)的组合。所述靶向基因修饰编码多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24这些氨基酸序列有至少80％的一致性。
[0105]
在某些实施例中，所述dna修饰是在相邻的基因组位点插入一个或多个核苷酸。例如，与该基因具有可操作地连接的表达调节元件(eme)的插入，如pct/us2018/025446中所述的eme。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以将内源多肽启动子替换为本领域内已知的具有高表达的其它启动子。在某些实施例中，所述靶向dna修饰可以是将本领域内已知的具有高表达的启动子插入到5’utr中，从而使内源多肽的表达由插入的启动子控制。在某些实施例中，所述dna修饰是优化kozak环境以增加表达的修饰。在某些实施例中，所述dna修饰是一种位点上的多核苷酸修饰或snp以调节表达蛋白的稳定性。
[0106]
使用本发明的方法的植物可以是本文描述的任何种类的植物。在某些实施例中，这些植物是玉米、大豆或水稻。
[0107]
多种方法可以被用于向植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒中引入目的序列。“引入”意指向植物、植物细胞、种子和/或谷物呈现本发明的多核苷酸或产生的多肽，其方式使该序列获得进入植物细胞内部的通路。本公开的方法不依赖于特定的将序列引入植物、植物细胞、种子和/或籽粒的方法，仅指所述多核苷酸或多肽获得进入植物中至少一个细胞的内部。
[0108]
转化方法以及将多肽或多核苷酸序列引入植物的方法可能因转化目标植物或植物细胞(即单子叶植物或双子叶植物)的类型而异。合适的向植物细胞引入多肽和多核苷酸的方法包括微量注射(crossway等(1986)biotechniques.4:320-334)、电穿孔(riggs等(1986)proc.natl.acad.sci.usa.83:5602 5606、农杆菌介导的转化(美国专利号5563055和美国专利号5981840)、直接基因转移(paszkowski等(1984)embo j.3:2717 2722)和弹道粒子加速(例如，见美国专利号4945050；美国专利号5879918；美国专利号5886244和5932782；tomes等人(1995年)，《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，ed.gamborg和phillips(柏林斯普林格
·
维拉格)；mccabe等人(1988年)生物技术6:923-926；和lec1转化(wo 00/28058)参见weissinger等(1988)ann.rev.genet.22:421-477；sanford等(1987)微
粒科学与技术5:27-37(洋葱)；christou等(1988)植物生理学87:671-674(大豆)；mccabe等(1988)生物/技术6:923-926(大豆)；finer and mcmullen(1991)生物体外细胞开发27p:175-182(大豆)；singh等(1998)theor.appl.genet.96:319-324(大豆)；datta等(1990)生物技术8:736-740(水稻)；klein等(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:4305-4309(玉米)；klein等(1988)生物技术6:559-563(玉米)；美国专利号5240855；5322783和5324646；klein等(1988)植物生理学91:440-444(玉米)；from等(1990)生物技术8:833-839(玉米)；hooykaas van slogteren等(1984)nature(伦敦)311:763-764；美国专利号5736369(谷物)；bytebier等(1987)proc.natl.acad.sci.usa 84:5345-5349(百合科)；de wet等(1985)胚珠组织的实验操作；ed.chapman等(纽约朗文)，第197-209页(花粉)；kaeppler等(1990)植物细胞报告9:415-418和kaeppler等(1992)theor.appl.genet.84:560-566(晶须介导的转化)；d'halluin等(1992)植物细胞4:1495-1505(电穿孔)；li等(1993)植物细胞报告12:250-255和christou and ford(1995)植物学年鉴75:407-413(水稻)；osjoda等(1996)nature biotechnology 14:745-750(农杆菌介导的玉米)；所有这些均通过引用并入本文。
[0109]
在其他实施例中，本文中公开的发明的多核苷酸可以通过植物接触病毒或病毒核酸引入。通常，这些方法涉及将本发明的核苷酸构建体并入dna或rna分子中。应该认识到，发明的多核苷酸序列可以被初步合成作为病毒聚蛋白的一部分，之后可在体内或体外通过蛋白质水解处理以产生所需的重组蛋白质。进一步的需要认识到，本文公开的启动子还包含利用病毒rna聚合酶转录的启动子。向植物引入多核苷酸并表达其编码的涉及到病毒dna或rna分子蛋白的方法在本领域内是已知的。例如，参见美国专利号5889191、5889190、5866785、5589367、5316931和porta等人(1996)分子生物技术5:209-221；此处通过引用并入本文。
[0110]
被转化的细胞可以按照常规培育成为植株。例如，参见mccormick等(1986)plant cell reports 5:81-84。之后，这些植物进行生长，并用相同的转化品系或者不同的品系授粉，并且鉴定出具有所需表型特征的组成型表达的后代。可以培育两代或更多代以确保稳定地保持和遗传所需的表型特征，然后收获种子以确保获得所需表型特征的表达。通过这种方式，本发明提供了具有本文公开的多核苷酸的转化种子(也称为“转基因种子”)例如，作为表达盒的一部分，稳定地并入其基因组中。
[0111]
植物转化技术获得的转化植物细胞，包括上面讨论的那些，能被培养以再生成为一整个拥有转化基因型(即，发明的多核苷酸)的植物，从而获得所需的表型，如增加的产量。关于玉米的转化和再生，见gordon-kamm等，植物细胞,2:603-618(1990)。
[0112]
多种方法可以被用于向基因组位点引入基因修饰，以在植物、植物部分、植物细胞、种子和/或籽粒中编码本文所述的多肽。在某些实施例中，所述靶向dna修饰通过以下基因组修饰技术：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)、工程化位点特异性巨核酸酶或argonaute。
[0113]
在某些实施例中，所述基因组修饰的促成可以通过诱导基因组内靠近所需改变的特定位点的双链断裂(dsb)或单链断裂。双链断裂(dsb)的诱导可以使用任何可获得的双链断裂诱导剂，包括但不限于，talens、巨核酸酶、锌指核酸酶、cas9-grna系统(基于细菌crispr-cas系统)、引导cpf1核酸内切酶系统，等等。在某些实施例中，双链断裂的引入能够
与多核苷酸修饰模板的引入相结合。
[0114]
多核苷酸修饰模板能够使用任何行业内已知的方法引入细胞，这些方法例如，但不限于，瞬时导入法、转染、电穿孔、微量注射、颗粒介导的递送、局部应用、晶须介导的递送、通过细胞穿透肽的递送或介孔二氧化硅纳米颗粒(msn)介导的直接递送。
[0115]
多核苷酸修饰模板能够作为一个单链多核苷酸分子、双链多核苷酸分子、或作为环状dna(载体dna)的一部分被引入细胞中。所述多核苷酸修饰模板能够被束缚在向导rna和/或cas内切酶上。
[0116]
一个“修饰核苷酸”或“编辑核苷酸”是指一种目的核苷酸序列，当与其未修饰的核苷酸序列相比较时，所述核苷酸序列含有至少一个改变。这种“改变”包括但不限于：(i)至少一个核苷酸的替换，(ii)至少一个核苷酸的缺失，(iii)至少一个核苷酸的插入，或(iv)任何(i)-(iii)的组合。
[0117]
术语“多核苷酸修饰模板”包括一个多核苷酸，当与要编辑的核苷酸序列相比较时，所述多核苷酸包含至少一个核苷酸修饰。一个核苷酸修饰能被至少一个核苷酸替换、插入或删除。通常，所述多核苷酸修饰模板能进一步包含至少一个核苷酸修饰侧翼的同源核苷酸序列，其中所述侧翼的同源核苷酸序列为所需核苷酸序列的编辑提供充足的同源物。
[0118]
结合双链断裂(dsb)和修饰模板编辑基因组序列的过程通常包括：提供一个宿主细胞；一种双链断裂诱导剂或一个核酸编码的双链断裂诱导剂，以识别染色体序列中的靶向序列并确保能诱导基因组序列中的双链断裂(dsb)；和至少一个多核苷酸修饰模板，当与待编辑的核苷酸序列相比时，含有至少一个核苷酸的改变。所述多核苷酸修饰模板能进一步包含至少一个核苷酸改变侧翼的核苷酸序列，其中所述侧翼序列与双链断裂侧翼的染色体区域基本同源。
[0119]
所述核酸内切酶能够通过任何本领域内已知的方法被提供给细胞，例如，但不限于，瞬时导入法、转染、微量注射和/或局部应用或通过重组结构间接应用。所述核酸内切酶能够作为蛋白或作为向导多核苷酸复合物被直接提供给细胞，或间接地通过重组构建体。使用本领域内已知的方法，核酸内切酶能够短暂地被引入细胞，或合并入宿主细胞的基因组内。在crispr-cas系统的情况下，如2016年5月12日出版的wo2016073433所述，细胞穿透肽(cpp)可促进内切酶和/或引导多核苷酸进入细胞。
[0120]
除了通过双链断裂技术进行修饰外，使用碱基编辑技术实现一个或多个无双链断裂的碱基的修饰，参见，gaudelli等，(2017)无dna切割的基因组dna中a*t到g*c的可编程碱基编辑，nature 551(7681)：464-471；komor等，(2016)无双链dna切割的基因组dna中目标碱基的可编程编辑，nature 533(7603)：420-425。
[0121]
这些融合包含dcas9或cas9切口酶和合适的脱氨酶，它们可以例如将胞嘧啶转化为尿嘧啶，而不诱导目标dna的双链断裂。然后尿嘧啶通过dna复制或修复转化为胸腺嘧啶。改进的具有靶向灵活性和特异性的碱基编辑器用于编辑内源基因位点以产生靶向变异并提高粮食产量。类似地，腺嘌呤碱基编辑器使腺嘌呤转变为肌苷，然后通过修复或复制转化为鸟嘌呤。因此，使用适当的位点特异性碱基编辑器，在一个或多个位置进行有针对性的碱基变化，即c
·
g到t
·
a转换和a
·
t到g
·
c转换。
[0122]
在一个实施例中，碱基编辑是一种基因组编辑方法，它能够在目标基因组位点将一个碱基对直接转换为另一个碱基对，而无需双链dna断裂(dsb)、同源性定向修复(hdr)过
程或外部供体dna模板。在一个实施例中，碱基编辑器包括(i)催化功能受损的crispr
–
cas9突变体，其突变使得其一个核酸酶结构域不能产生dsb；(ii)单链特异性胞苷/腺嘌呤脱氨酶，在cas9产生的单链dna泡中的适当核苷酸窗口内将c转化为u或a转化为g；(iii)尿嘧啶糖基化酶抑制剂(ugi)，阻碍尿嘧啶切除和下游过程，降低碱基编辑效率和产品纯度；(iv)活性核酸内切酶，以切割未编辑的dna链，然后进行细胞dna修复过程以替换含g的dna链。
[0123]
如本文所用，“基因组区域”是细胞基因组中存在于靶位点任一侧的染色体片段，或者也包括靶位点的一部分。所述基因组区域包括至少5-10、5-15、5-20、5-25、5-30、5-35、5-40、5-45、5-50、5-55、5-60、5-65、5-70、5-75、5-80、5-85、5-90、5-95、5-100、5-200、5-300、5-400、5-500、5-600、5-700、5-800、5-900、5-1000、5-1100、5-1200、5-1300、5-1400、5-1500、5-1600、5-1700、5-1800、5-1900、5-2000、5-2100、5-2200、5-2300、5-2400、5-2500、5-2600、5-2700、5-2800、5-2900、5-3000、5-3100或更多碱基，使得基因组区域拥有充足的同源物以在相应的同源区域进行同源重组。
[0124]
tal效应物核酸酶(talen)是一类序列特异性核酸酶，可用于在植物或其他生物体基因组中的特定目标序列处进行双链断裂(miller等(2011)nature biotechnology 29:143
–
148)。
[0125]
核酸内切酶是在多核苷酸链内切割磷酸二酯键的酶。核酸内切酶包括限制性内切酶，其在特定位点切割dna而不损伤碱基；以及巨核酸酶，也称为归巢内切酶(heases)，其与限制性内切酶一样，在特定识别位点结合和切割，但是巨核酸酶的识别位点通常较长，约18bp或更长(专利申请pct/us12/30061，于2012年3月22日提交)。根据保守的序列基序，巨核酸酶被分为四个家族，分别是laglidadg、giy-yig、h-n-h和his-cys box家族。这些基序参与金属离子的配位和磷酸二酯键的水解。归巢内切酶(heases)因其长识别位点和耐受dna底物中的某些序列多态性而著名。巨核酸酶的命名惯例类似于其他限制性内切酶的命名惯例。对于分别由独立orf、内含子和内含子编码的酶，巨核酸酶也以前缀f-、i-或pi-为特征。重组过程中的一个步骤涉及多核苷酸在识别位点或其附近进行切割。切割活性可用于产生双链断裂。有关位点特异性重组酶及其识别位点的综述，请参见sauer(1994)curr-op biotechnol 5:521-7；以及sadowski(1993)faseb 7:760-7。在一些示例中，重组酶来自整合酶或分解酶家族。
[0126]
锌指核酸酶(zfns)是由锌指dna结合结构域和双链断裂诱导结构域组成的工程化双链断裂诱导剂。识别位点特异性通常包含两个、三个或四个锌指(例如具有c2h2结构)的锌指结构域赋予，但是其他锌指结构是已知的并且已经被工程化。锌指结构域适合于设计特异性结合选定的多核苷酸识别序列的多肽。锌指核酸酶(zfn)包括与非特异性核酸酶内切结构域连接的工程化dna结合锌指结构域，例如来自ii型内切核酸酶如foki的核酸酶结构域。其他功能可以与锌指结合结构域融合，包括转录激活因子结构域、转录抑制因子结构域和甲基化酶。在一些实例中，切割活性需要核酸酶结构域的二聚化。每个锌指识别靶dna中的三个连续碱基对。例如，3-指结构域识别9个连续核苷酸的序列，核酸酶需要二聚化，两组锌指三联体用于结合18个核苷酸的识别序列。
[0127]
使用dsb诱导剂(例如cas9-grna复合物)进行基因组编辑已被发现，例如2015年3月19日发布的美国专利申请us 2015-0082478 a1，2015年2月26日发布的wo2015/026886 a1，2016年1月14日发布的wo2016/007347和2016年2月18日发布的wo2016/25131，所有这些
都通过引用并入本文。
[0128]
实例
[0129]
以下是本发明某些方面的具体实施例的实例。这些实施例仅用于说明目的，并不以任何方式限制本发明的范围。
[0130]
实例1
[0131]
抗虫基因的克隆和载体构建
[0132]
使用含有来自花椰菜花叶病毒35s(camv 35s)启动子的四重多聚增强子元件的双元构建体，并且水稻活化标记群体由四种粳稻(oryza sativa ssp.japonica)品种(中花11号、超优1号、台中65和日本晴)开发，如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547所述，通过农杆菌介导转化的方法转化。产生的转基因株系苗种植生长，并和收获的转基因种子构成水稻激活标签突变体群体。
[0133]
抗虫性标签株系(atls)在田间重复试验中得到证实，并确定了它们的t-dna插入位点。所述基因在克隆t-dna左边界和右边界的附近，并通过实验室筛选重现功能基因。本文仅显示了概括的功能基因。并且基于表2中所示的这些基因的loc id，设计引物用于克隆水稻抗虫基因osaak1、osdn-itp8、ospmr5、oserv-b、osbhlh065、osgrp1、osap2-4、osduf630/duf632。
[0134]
表2.水稻基因名称、基因id(来自tigr)和构建体id
[0135][0136][0137]
使用试剂盒在琼脂糖凝胶电泳后提取pcr扩增产物，然后与ta克隆载体连接。通过测序确认这些构建体中的序列和方向。将每个基因克隆到植物双元构建体中。
[0138]
实例2
[0139]
转基因水稻株系的转化
[0140]
中花11号(oryza sativa l.)用实施例1中制备的载体或空载体(dp0158)通过农杆菌介导的方法(如lin和zhang((2005)plant cell rep.23:540-547)所述)进行转化。将转化实验产生的转基因幼苗(t0)移植到田间以获得t1种子。筛选t1和随后的t2种子以确认转化，并将阳性鉴定的转基因种子用于以下性状筛选。
[0141]
实例3
[0142]
通过acb分析转基因水稻的表征
[0143]
亚洲玉米螟(acb，ostrinia furnacalis(guen
é
e))是亚洲玉米的重要昆虫害虫，广泛分布在中国大陆、澳大利亚以及所罗门岛屿，在其北部区域，每年成虫蛾会产生一到几代，在热带区域，世代之间是连续并重叠的。幼虫通过损害籽粒和取食穗、叶和茎导致玉米产量损失严重，幼虫主要在植物的生殖器官部分存活和生长。其它受危害的经济作物包括辣椒、生姜和高粱。近来，亚洲玉米螟似乎已成为棉花的重要害虫，一些野生杂草也成为亚洲玉米螟的宿主(d.m.nafusa和i.h.schreinera.2012.review of the biology and control of the asian corn borer,ostrinia furnacalis(lep：pyralidae)tropical pest management.37:41-56)。
[0144]
acb昆虫用于鉴定可抑制幼虫发育的水稻植物。亚洲玉米螟种群来自中国农业科学院植物保护研究所。该群体在25-27℃，60-80％相对湿度下，在16l:8d的光照期下饲养超过10代。给幼虫喂食人工饲料(zhou darong，ye zhihua，wang zhenying，1995)，并将卵在27℃的培养箱中孵化。将新孵化的幼虫用于测定。
[0145]
用该构建体产生的t2植物在测定中测试三次，每次四至六个重复。zh11-tc和dp0158的幼苗用作对照。测试了10个品系的转基因水稻，每个品系取450粒种子用于测试。所有种子在32℃下用800ppm多菌灵灭菌8小时并洗涤3-5次，然后置于培养皿(12
×
12cm)中的湿纱布层上。将发芽的种子在28℃的蒸馏水中培养10天，并将8-10cm高的幼苗用于喂养acb幼虫。
[0146]
使用随机区组设计，并且在一个实验单元中测试来自构建体的10个转基因株系，以考虑构建体、株系和环境效应，通过sas proc glimmix评估基因功能。如果转基因水稻植株在构建体和株系水平上的幼虫生长抑制率显著高于对照(p《0.05)，则认为该基因具有acb耐受功能。
[0147]
选择每孔中三个最大的幼虫，与zh11-tc幼苗孔中的幼虫进行比较，然后根据表3获得耐受值。如果对照幼虫发育良好至三龄期，则认为幼虫发育正常，耐受值为0；如果幼虫发育到二龄期，则与正常发育的幼虫相比较小，耐受值为1；如果幼虫发育到第一龄，它非常小，耐受值为2。
[0148]
表3.亚洲玉米螟评分量表
[0149][0150]
幼虫生长抑制率用作acb昆虫耐受性测定的参数，其是抑制幼虫数占幼虫统计数的百分比，其中抑制幼虫数是孔中试验昆虫耐受值的总和，统计幼虫数是所有观察到的昆虫数和一龄幼虫数的总和。然后用卡方分析原始数据，p《0.01的株系被认为是acb耐受阳性株系。
[0151]
为了研究来自实施例2的osaak1、osdn-itp8、ospmr5、oserv-b、osbhlh065、osgrp1、osap2-4、osduf630/duf632转基因水稻植物是否具有抗虫性，所有转基因水稻植株
和zh11-tc和dp0158水稻植物针对acb昆虫进行测试。
[0152]
(1)osaak1转基因水稻植株的acb筛选结果
[0153]
osaak1转基因水稻植物测试三次。所有实验表明，osaak1转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。
[0154]
在第一次实验中，将10个osaak1转基因品系置于一个平板上，并重复5次。acb新生幼虫接种幼苗5天后，acb昆虫对zh11-tc和dp0158幼苗的损伤明显，而osaak1转基因幼苗的损伤较小，osaak1转基因幼苗的摄食量小于zh11-tc和dp0158对照。接种后5天，发现464只幼虫，16只幼虫发育至一龄期，193只幼虫发育至二龄期。zh11-tc幼苗孔中的两个幼虫发育到一龄期，63个幼虫发育到二龄期；在dp0158幼苗的孔中，5只幼虫发育到一龄期，55只幼虫发育到二龄期。osaak1转基因水稻，zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为47％、40％和37％。osaak1转基因水稻的平均幼虫生长抑制率高于zh11-tc对照，显著高于dp0158对照。这些结果表明，osaak1基因在水稻中的过量表达显著提高了转基因水稻在构建体水平上的acb昆虫耐受性。
[0155]
转基因株系水平的进一步分析见表4。三个转基因株系表现出比dp0158对照显著更高的幼虫生长抑制率。这些结果进一步表明，在株系水平下，与对照相比，osaak1在增加水稻的acb昆虫耐受性中起作用。
[0156]
表4.在实验室筛选条件下osaak1转基因水稻的acb分析
[0157][0158]
[0159]
(2)osdn-itp8转基因水稻植株的acb筛选结果
[0160]
osdn-itp8转基因水稻植物测试三次。所有实验表明，osdn-itp8转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率大于zh11-tc和dp0158对照。其中两个显著大于zh11-tc对照，其中一个显著大于dp0158对照。
[0161]
在第三次实验中，将10个osdn-itp8转基因株系置于一个32孔板上，重复6次。接种后5天，发现624只幼虫中，6只幼虫发育至一龄期，316只幼虫发育至二龄期。zh11-tc幼苗孔中，203只幼虫中有60只发育至二龄期；在dp0158幼苗孔中，204只幼虫中有1只发育到一龄期，71只幼虫发育到二龄期。osdn-itp8转基因水稻，zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为52％、30％和36％。osdn-itp8转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，osdn-itp8在水稻中的过量表达，显著提高了转基因水稻在构建体水平上的acb昆虫耐受性。
[0162]
转基因株系水平的进一步分析见表5。10个转基因株系表现出比zh11-tc对照显著更高的幼虫生长抑制率；7个株系表现出比dp0158对照显著更高的幼虫生长抑制率。这些结果进一步表明，在株系水平上与对照相比，osdn-itp8在增加水稻的acb昆虫耐受性中起作用。
[0163]
表5.osdn-itp8转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0164][0165][0166]
(3)ospmr5转基因水稻的acb筛选结果
[0167]
对ospmr5转基因水稻植株进行了三次试验。所有试验表明，ospmr5转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率高于dp0158对照，显著高于zh11-tc对照。
[0168]
在第一次实验中，将10个ospmr5转基因系放置在一个32孔板上，重复5次。接种5天后，共发现373只幼虫中，13只发育到一龄期，140只发育到二龄期。在zh11-tc幼苗孔中，140只幼虫中有2只发育到一龄期，31只发育到二龄期；在dp0158幼苗孔中，148只幼虫中有3只发育到一龄期，52只发育到二龄期。ospmr5转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为43％、25％和38％。ospmr5转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，ospmr5在水稻中的过量表达，在构建体水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0169]
转基因株系水平的进一步分析如表6所示。6个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照株系。这些结果进一步表明，在株系水平上，与对照相比，ospmr5在提高水稻对acb的抗虫性方面发挥了作用。
[0170]
表6.ospmr5转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0171][0172][0173]
(4)oserv-b转基因水稻的acb筛选结果
[0174]
对oserv-b转基因水稻植株进行了三次试验。两次试验表明，oserv-b转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率高于zh11-tc对照，且显著高于dp0158对照。
[0175]
在第三次实验中，将10个oserv-b转基因株系置于一个32孔板上，重复6次。接种5
天后，共发现554只幼虫中，71只发育到一龄期，278只发育到二龄期。在zh11-tc幼苗孔中，194只幼虫中有4只发育到一龄期，108只发育到二龄期；在dp0158幼苗孔中，192只幼虫中有10只发育到一龄期，98只发育到二龄期。oserv-b转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为67％、59％和58％。oserv-b转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，oserv-b在水稻中的过量表达，在构建体水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0176]
转基因株系水平的进一步分析如表7所示。三个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照株系。这些结果进一步表明，在株系水平上，与对照相比，oserv-b在提高水稻抗虫性方面发挥了作用。
[0177]
表7.oserv-b转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0178][0179][0180]
(5)osbhlh065转基因水稻的acb筛选结果
[0181]
对osbhlh065转基因水稻植株进行了三次试验。两个实验表明，osbhlh065转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。
[0182]
10.1.21在第三个实验中，将10个osbhlh065转基因系放置在一个具有6个重复的32孔板上。接种5天后，共发现579只幼虫，其中9只发育到一龄期，238只发育到二龄期。zh11-tc幼苗井中189只幼虫中有3只发育到一龄期，45只发育到二龄期；在dp0158幼苗井中，195只幼虫中有42只发育到二龄期。osbhlh065转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼
虫生长抑制率分别为44％、27％和22％。osbhlh065转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，osbhlh065在水稻中的过量表达，在构建水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0183]
转基因株系水平的进一步分析如表8所示。与zh11-tc和dp0158对照相比，8个转基因株系表现出显著更高的幼虫生长抑制率。这些结果进一步表明，在株系水平上，与对照相比，osbhlh065在提高水稻抗虫性方面发挥了作用。
[0184]
表8.osbhlh065转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0185][0186]
(6)osgrp1转基因水稻的acb筛选结果
[0187]
对osgrp1转基因水稻植株进行了三次试验。两次试验表明，osgrp1转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。
[0188]
在第一次实验中，将10个osgrp1转基因株系放置在一个32孔板上，重复5次。接种5天后，共发现332只幼虫中，48只发育到一龄期，139只发育到二龄期。在zh11-tc幼苗孔中，123只幼虫中有10只发育到一龄期，43只发育到二龄期；在dp0158苗孔中，120只幼虫中有11只发育到一龄期，30只发育到二龄期。osgrp1转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为62％、47％和40％。osgrp1转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，osgrp1在水稻中的过量表达，在构建体水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0189]
在转基因株系水平上的进一步分析如表9所示。四个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照株系。五个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于对照株系dp0158。这些结果进一步表明，与对照相比，osgrp1在株系水平上在提高水稻acb抗虫性方面发挥了作用。
[0190]
表9.osgrp1转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0191][0192]
(7)osap2-4转基因水稻的acb筛选结果
[0193]
对osap2-4转基因水稻植株进行了三次试验。所有试验表明，osap2-4转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率高于zh11-tc和dp0158对照。
[0194]
在第二次实验中，将10个osap2-4转基因株系放置在一个32孔板上，重复6次。接种5天后，共发现676只幼虫中，8只发育到一龄期，300只发育到二龄期。在zh11-tc苗孔中，193只幼虫中有76只发育到二龄期；在dp0158苗孔中，205只幼虫中有47只发育到二龄期。osap2-4转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为46％、39％和23％。osap2-4转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。这些结果表明，osap2-4在水稻中的过量表达，在构建体水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0195]
转基因株系水平的进一步分析如表10所示。两个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照株系。10个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于对照株系dp0158。这些结果进一步表明，在株系水平上，与对照相比，osap2-4在提高水稻抗虫性方面发挥了作
用。
[0196]
表10.osap2-4转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0197][0198]
(8)osduf630/duf632转基因水稻的acb筛选结果
[0199]
对osduf630/duf632转基因水稻植株进行了两次试验。所有试验表明，osduf630/duf632转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率大于zh11-tc和dp0158对照。
[0200]
在第一次实验中，将10个osduf630/duf632转基因株系放置在一个32孔板上，重复6次。接种5天后，共发现562只幼虫中，10只发育到一龄期，225只发育到二龄期。zh11-tc苗孔中187只幼虫中有48只发育到二龄期；dp0158苗孔中181只幼虫中有5只发育到一龄期，67只发育到二龄期。osduf630/duf632转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为43％、26％和41％。osduf630/duf632转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照。这些结果表明，osduf630/duf632在水稻中的过量表达，在构建体水平上显著提高了转基因水稻的抗虫性。
[0201]
转基因株系水平的进一步分析如表11所示。六个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照株系。其中一个转基因株系的幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照株系。这些结果进一步表明，与对照相比，osduf630/duf632在提高水稻抗虫性方面发挥了作用。
[0202]
表11.osduf630/duf632转基因水稻在实验室筛选条件下的acb分析
[0203][0204]
综上所述，这些结果表明，与对照植物相比，osaak1、osdn-itp8、ospmr5、oserv-b、osbhlh065、osgrp1、osap2-4和osduf630/duf632转基因水稻植物对acb昆虫的耐受性有所提高。
[0205]
实例4
[0206]
转基因水稻植株的oaw鉴定
[0207]
东方粘虫(oaw)用于杀虫活性的交叉验证。oaw属于鳞翅目夜蛾科，是一种多食性害虫。oaw的卵来自中国农业科学院植物保护研究所，并在27℃的培养箱中孵化。新生幼虫用于交叉验证试验。
[0208]
如实施例3所述培养水稻植株，实验设计与实施例3所述的acb昆虫试验相似。五天后，目测所有存活的幼虫，并根据表3给出耐受值。
[0209]
幼虫生长抑制率用作本次抗虫性试验的参数，即抑制数占幼虫统计数的百分比。其中，抑制数为一次重复中四个孔所有观察到的试验昆虫的耐受值之和，幼虫统计数为所有观察到的昆虫数与一龄期幼虫数之和。
[0210]
原始数据经卡方检验，p《0.01的株系为耐oaw阳性株系。
[0211]
(1)osaak1转基因水稻的oaw筛选结果
[0212]
对osaak1转基因水稻植株进行了四次试验。所有试验均表明，转基因水稻植株osaak1的平均幼虫生长抑制率高于对照dp0158。其中两个显著高于dp0158对照组。
[0213]
在第二次实验中，将10个osaak1转基因株系置于一个32孔板上，并重复6次。接种5天后，在osaak1转基因水稻苗孔中发现657只幼虫，其中201只发育到二龄期。zh11-tc对照水稻幼苗孔中的172只幼虫中，有1只发育到一龄期，32只发育到二龄期；dp0158对照水稻苗孔中192只幼虫中有2只发育到一龄期，26只发育到二龄期。osaak1转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为31％、20％和15％。osaak1转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，osaak1在水稻中的过量表达在构建体水平上显著提高了转基因水稻的oaw抗虫性。
[0214]
转基因株系水平的进一步分析如表12所示。五个株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照；七个株系的幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。这些结果进一步表明，在株系水平上，与对照相比，osaak1在提高水稻对oaw的耐受性方面发挥了作用。
[0215]
表12.osaak1转基因水稻在实验室筛选条件下的oaw分析
[0216][0217]
(2)osdn-itp8转基因水稻的oaw筛选结果
[0218]
对osdn-itp8转基因水稻植株进行了三次试验。所有试验表明，osdn-itp8转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率大于zh11-tc和dp0158对照。其中两次试验表明，osdn-itp8转基因水稻植株的平均幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。
[0219]
在第一次实验中，将10个osdn-itp8转基因株系置于一个32孔板上，并重复6次。接种4天后，在osdn-itp8转基因水稻苗孔中发现610只幼虫，其中24只发育到二龄期，123只发
育到二龄期。zh11-tc对照苗孔中190只幼虫中有9只发育到一龄期，19只发育到二龄期；dp0158对照苗孔中175只幼虫中有5只发育到一龄期，15只发育到二龄期。osdn-itp8转基因水稻、zh11-tc和dp0158的平均幼虫生长抑制率分别为27％、19％和14％。osdn-itp8转基因水稻的平均幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc和dp0158对照。这些结果表明，osdn-itp8在水稻中的过量表达在构建体水平上显著提高了转基因水稻的oaw抗虫性。
[0220]
转基因株系水平的进一步分析如表13所示。三个株系的幼虫生长抑制率显著高于zh11-tc对照；七个株系的幼虫生长抑制率显著高于dp0158对照。这些结果进一步表明，与对照相比，osdn-itp8在品系水平上在提高水稻对oaw的耐受性方面发挥了作用。
[0221]
表13.osdn-itp8转基因水稻在实验室筛选条件下的oaw分析
[0222][0223]
综上所述，这些结果表明，与对照植物相比，osaak1和osdn-itp8转基因水稻植物对oaw昆虫的耐受性增强。

技术特征：
1.一种分离的多核苷酸，其含有的多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性，其中植物中所述多核苷酸表达量的增加能提高抗虫性。2.权利要求1所述的分离的多核苷酸，其中所述多核苷酸含有的核苷酸序列为seq id no:1、seq id no:2、seq id no:4、seq id no:5、seq id no:7、seq id no:8、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:22或seq id no:23。3.权利要求1所述分离的多核苷酸，其中所述编码的多肽的氨基酸序列为seq id no:3、seq id no:6、seq id no:9、seq id no:12、seq id no:15、seq id no:18、seq id no:21或seq id no:24。4.权利要求1-3所述的任意分离的多核苷酸，植物中所述多核苷酸表达量的增加能提高抗虫性。5.权利要求1-3所述的任意的多核苷酸，其中所述的害虫是鳞翅目昆虫。6.权利要求5所述的分离的多核苷酸，其中所述的害虫是亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)或东方粘虫(mythimna separata)。7.一种重组dna构建体，包含权利要求1-3中任意分离的多核苷酸，所述重组dna构建体可操作地连接至少一个异源调控元件。8.权利要求7所述的重组dna构建体，其中所述的调控元件是一种异源启动子。9.一种改良的植物或种子，含有至少一种表达量增加的多核苷酸，所述多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。10.权利要求9所述的植物，其中所述植物在其基因组中含有一种重组dna构建体，其包含的权利要求1-3中任意的多核苷酸可操作地连接至少一个调控元件，其中所述植物在与对照植物相比较时，表现出增加的抗虫性。11.权利要求9所述的植物，其中该植物在其基因组位点上含有一种靶向基因修饰，该靶向基因修饰含有的多核苷酸序列编码的多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性，因而增加所述多肽的表达量，所述植物与对照植物相比较时，表现出提高的抗虫性。12.权利要求9-11所述的任意植物，其中所述害虫是鳞翅目。13.权利要求12所述的植物，其中所述害虫是亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)或东方粘虫(mythimna separata)。14.权利要求9-13所述的植物，其中所述植物选自：水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、小米、甘蔗和柳枝稷。15.一种增加植物抗虫性的方法，包括增加至少一种编码多肽的多核苷酸的表达，所述多肽的氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性。16.权利要求15所述的方法，其中所述方法包括：a)在可再生植物细胞中表达一种重组dna构建体，所述重组dna构建体含有一种调控元件可操作地连接所述多核苷酸序列；和b)再生所述植物，其中该植物在其基因组中含有所述重组dna构建体。17.权利要求16所述的方法，其中所述调控元件是一种异源启动子。
18.权利要求15所述的方法，其中所述方法包括：a)向可再生植物细胞的基因组位点上引入一个靶向基因修饰，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21或24有至少90％的序列一致性；和b)再生所述植物，其中所述多肽在植物中的水平和/或表达时增加的。19.权利要求18所述的方法，其中所述靶向基因修饰的引入使用了基因组修饰技术，包括：多核苷酸引导的核酸内切酶、crispr-cas核酸内切酶、碱基编辑脱氨酶、锌指核酸酶、转录激活物样效应器核酸酶(talen)工程化位点特异性巨核酸酶、或argonaute。20.权利要求18所述的方法，其中所述靶向基因修饰存在于基因位点的(a)编码区；(b)非编码区；(c)调控序列；(d)非翻译区；(e)任意(a)-(d)的组合，以编码含有氨基酸序列的多肽，所述氨基酸序列与seq id no:3、6、9、12、15、18、21和24这些序列有至少90％的一致性。21.权利要求15所述的方法，其中所述害虫为鳞翅目。22.权利要求21所述的方法，其中所述害虫为亚洲玉米螟(ostrinia furnacalis)或东方粘虫(mythimna separata)。

技术总结
本公开发明中披露了分离的多核苷酸和多肽以及重组DNA构建体，对于赋予植物更高的抗虫性起着重要的作用；还披露了含有这些重组DNA构建体的组合物(例如植物或种子)，以及利用这些重组DNA构建体的方法。所述重组DNA构建体含有的多核苷酸可操作地连接在植物中有功能的启动子，其中所述多核苷酸编码抗虫多肽。其中所述多核苷酸编码抗虫多肽。

技术研发人员：吕贵华王国奎毛冠凡焦荣荣刘爱芬钟丰
受保护的技术使用者：先锋海外公司
技术研发日：2019.07.01
技术公布日：2022/3/11