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基于UPLC-Q-TOF-MS/MS网络药理学的九制黄精与生黄精对脂多糖诱导RAW 264.7细胞炎症反应的抑制作用差异研究

来源：花匠小妙招时间：2026-01-05 17:05

黄精为百合科植物滇黄精Polygonatum kingianumColl. et Hemsl.、黄精Polygonatum sibiricumRed. 或多花黄精Polygonatum cyrtonemaHua的干燥根茎，是传统药食两用中药材[1]。其功效聚焦肺、脾、肾三脏，既能滋阴润肺，改善肺阴不足所致的干咳少痰、咽干口燥等症状；又能健脾益气、补气养阴，缓解脾胃虚弱引发的食欲不振、腹胀、乏力等问题；还可益肾填精，针对肾精亏虚导致的腰膝酸软、须发早白、耳鸣健忘等早衰表现发挥作用。黄精富含生物碱、皂苷、糖类、黄酮类等多种化学成分[2-4]，现代药理研究证实其具有抗氧化、抗疲劳、增强免疫力及抗炎等多种生物活性[5]。生黄精因含草酸钙针晶，不仅服用时存在麻舌感[6]，且具有一定毒性，故临床多采用其炮制品。九蒸九制为黄精经典炮制工艺，应用历史已逾1 800年，通过九次蒸煮、九次晒干的处理，可显著降低生黄精中草酸钙针晶含量，既减毒增效，又强化其滋补功效，对现代中药炮制研究具有重要参考价值。

炎症是机体免疫系统的防御性反应，核心目的是清除有害刺激、修复受损组织并恢复内环境稳态，既是多种疾病的核心病理过程，也可分为急性短期反应与慢性持续状态[7]。炎症的诱发因素多样，感染、组织损伤、自身免疫异常及异物入侵等均可能启动炎症反应[8-10]，其中细菌、真菌、病毒等病原体入侵是主要诱因之一。病原体感染可引发炎症级联反应，导致白细胞介素（IL）-6、肿瘤坏死因子（TNF）-α等促炎因子水平升高，进而激活免疫系统。在急性炎症阶段，IL-6会快速上调，通过激活免疫细胞、促进肝脏合成急性期蛋白（如C反应蛋白）等途径清除病原体并启动组织修复[11]；但长期高水平的IL-6可诱发类风湿性关节炎等慢性炎症[12-13]，其机制与激活信号转导与转录激活因子3（STAT3）信号通路、促进促炎因子正反馈循环及抑制抗炎因子表达相关。TNF-α作为关键促炎细胞因子，在炎症反应与病理损伤中起核心作用[14]，由活化的巨噬细胞、T细胞、脂肪细胞等分泌，通过与肿瘤坏死因子受体（TNFR）1/TNFR2受体结合，激活下游核因子-κB（NF-κB）及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路，诱导促炎因子释放[15]。消除炎症不仅能缓解红、肿、热、痛等表观症状，更可通过调节免疫平衡、修复组织损伤、阻断炎症恶性循环等机制，从根本上改善机体生理功能。

网络药理学由霍普金斯于2007年提出，是融合药理学、生物信息学、计算机科学等多学科的新兴技术。该理论认为药物并非仅通过单一靶点发挥作用，而是借助多靶点相互作用实现减毒增效，其多靶点、协同作用的核心概念与中药成分复杂、多效协调的特点高度契合，为中药多成分-多靶点作用机制研究提供了全新思路。该技术可系统解析中药成分、药物靶点与疾病间的相互作用，阐明成分-靶点-疾病的关联机制及治病原理[16]。

目前国内外关于黄精作用机制的研究多聚焦于生黄精，而九制黄精作为临床常用炮制品，其在化学成分构成、药理活性及现代疾病治疗中的相关文献报道较少。为此，本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析九制黄精与生黄精的化学成分差异，结合网络药理学、分子对接技术及细胞实验，在脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7炎症细胞模型中验证九制黄精的抗炎作用，并与生黄精进行对比。通过明确九制黄精的抗炎效应，阐明其抗炎活性与滋补功效的关联，为九制黄精的临床应用与产品开发提供科学依据。

1材料

1.1仪器

LC-40D X3型高效液相色谱仪，日本岛津公司；Zeno TOF 7600美国AB SCIEX公司；Milli-Q Synthesis 型超纯水纯化机，美国Millipore公司；CO2 Incubator BB 150细胞培养箱，美国赛默飞公司；XDS-1B生物显微镜，重庆重光实业；UV-2550紫外可见光分光光度计，日本岛津公司；HH-6恒温水浴锅，上海梅香仪器；Varioskan LUX多功能酶标仪，美国赛默飞公司；BXM-30R高压蒸汽灭菌锅，上海博讯医疗生物仪器；TGL-16M高速冷冻离心机，常州亿能实验仪器厂。

1.2试剂

1.3细胞

小鼠单核巨噬细胞（RAW 264.7），由江西中医药大学癌症中心提供。细胞使用10%胎牛血清的DMEM培养基进行培养，放入37 ℃，5% CO2恒温培养箱中培育，1～2 d换液或传代。

1.4数据库与软件

PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm. nih.gov/）；TCSMP数据库（https://old.tcmsp-e.com/ tcmsp.php)；Swiss Target Prediction数据库（http:// swisstarget prediction.ch/）；GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）；OMIM数据库（https://www.omim.org）；STRING数据库（https:// string-db.org/）；NCBI 数据库（https://www. ncbi.nlm. nih.gov/）；微生信（http://www. bioinformatics.com.cn/）；Cytoscape 3.9.1；Peakview 1.2；SIMCA 14.1；Origin 10.1；AutoDock 4.2.6；Pymol 3.9.2。

2方法

2.1化学成分分析

2.1.1九制黄精的制备[17]生黄精洗净，除去须根。20 %黄酒浸泡1 h入蒸笼，隔水蒸制4.5 h。取出，55 ℃烘至内外湿度均匀。如此反复循环9次，至黄精色泽乌黑油润，味甘甜，得九制黄精。

2.1.2供试品溶液的制备九制黄精或生黄精粉碎（过40目筛），每份0.2 g，加5 mL 50%甲醇水，40℃、150 W、40 kHz超声提取40 min，13 000r·min−1离心10 min，取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。

2.1.3色谱条件采用LC-40D C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱；柱温40 ℃；体积流量0.3 mL·min−1；进样量4 μL；流动相洗脱条件见表1。

2.1.4 质谱条件电子喷雾电离（ESI）源，正、负离子扫描模式，扫描范围为m/z50～1 500，离子源电压分别为5 500 V和−4 500 V，离子源温度为500 ℃，去簇电压为100 V，碰撞能量分别为（35±15）eV和（−35±15）eV，碰撞能谱（CES）为15 eV。雾化气体为氮气，辅助气体1为345 kPa，辅助气体2为345 kPa，帘气为276 kPa。

2.2数据处理

使用Peakview 1.2软件对质谱检测数据进行分析，使用Origin 2024（10.1.0.178）绘制分析离子流图，将Peakview 1.2检测得出的成分数据，以峰面积为变量使用SIMCA 14.1进行主成分分析（PCA）。

2.3网络药理学研究

2.3.1九制黄精成分靶点预测将UPLC-Q-TOF-MS/MS鉴定出的九制黄精化学成分利用中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP），以口服生物利用度（OB）＞30%和类药性（DL）＞0.18为条件筛选符合标准的成分，利用PubChem数据库查找成分的SMILES结构，将其导入Swiss Target Prediction数据库，设定物种为“Homo sapiens”，预测各成分对应的潜在靶点。每个成分仅保留可能性＞0的预测靶点，汇总所有候选成分的靶点并剔除重复项，得到九制黄精的药物靶点集。

2.3.2炎症靶点获取采用GeneCards、NCBI、OMIM数据库检索“Inflammation”关键词，汇总整理靶点信息，对数据库的检索结果去除重复项，得到炎症相关疾病的最终靶点。

2.3.3“成分-交集靶点”网络的构建采用Venny2.1.0对九制黄精成分靶点与炎症靶点取交集，得到交集靶点Venn图。

2.3.4共同靶点及蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络构建与核心靶点筛选采用STRING数据库对交集靶点进行蛋白交互分析，交互因子设为0.4，隐藏游离靶点，将网络信息导出为“TSV”文件，网络图导出为“PNG”文件，采用Cytoscape 3.9.1软件通过拓扑分析得到网络图，采用MCODE插件筛选核心靶点，所有参数均为默认参数，选的得分最高的PPI子网络进行可视化，其颜色越深、图标越大代表度（Degree）值越大。

2.3.5基因本体（GO）注释和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析利用DAVID数据库对九制黄精有效成分和炎症的共同靶标进行GO和KEGG富集分析，通过微生信对显著性较强的通路与功能进行可视化。

2.4分子对接

根据网络药理学分析的结果，筛选出度值前5位的活性成分和核心靶点进行分子对接；利用AutoDock 4.2.6优化预处理后的受体蛋白、配体化合物参数，设对接区域三维坐标，借网格计算生成配置文件，再设对接框、导出GPF文件，配置参数与运算方法后运行，查看结果；采用Pymol 3.9.2对结果做可视化分析。

2.5CCK-8法检测细胞活力

2.5.1黄精提取物制备取九制黄精与生黄精适量，各加20倍的超纯水，50 ℃，功率100 W，频率40 kHz，超声提取1 h，滤过后合并滤液，重复3次，浓缩至2 g·mL−1，即得九制黄精水提物（NPA）和生黄精水提物（RPA）。经紫外分光光度计检测，NPA、RPA中总多糖质量分数分别为12.34%、16.49%，总黄酮质量分数分别为2.25%、1.84%。

2.5.2NPA和RPA质量浓度筛选取对数生长期的RAW 264.7细胞，以1×105个·mL−1的密度接种于96孔板，每孔100 μL。置于37 ℃、5% CO₂培养箱中预培养24 h（待细胞贴壁）。弃去原有培养基后分为对照组、NPA组、RPA组，其中NPA与RPA组均设置1、10、50、100、200、400、800 μg·mL−1共7个质量浓度梯度（以细胞培养基稀释配制），每组设3个复孔，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中孵育24 h；另设空白组（仅加入细胞培养基，无细胞）。

2.5.3造模后NPA和RPA质量浓度筛选取对数生长期的RAW 264.7细胞，以1×105个·mL−1的密度接种于96孔板，每孔100 μL，置于37℃、5% CO₂培养箱中预培养24 h以确保细胞充分贴壁。弃去孔内原有培养基后，将细胞分为对照组、模型组、NPA组及RPA组。当RPA质量浓度达到800μg·mL−1时细胞活性呈下降趋势，为避免药物浓度过高对细胞活性产生非特异性影响而干扰实验结果，本实验设置100、200、400 μg·mL−1 3个质量浓度梯度，所有药物均以细胞培养基稀释配制。各组均设3个复孔，除对照组外，其余各组每孔均加入100 μL 1μg·mL−1LPS进行造模[18]，随后分别加入对应质量浓度的药物；同时另设空白组，该组仅加入细胞培养基，不接种细胞。

药物干预完成后，每孔加入CCK-8检测溶液，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中继续孵育1 h，随后使用酶标仪在490 nm波长处测定各孔吸光度（A）值，并以对照组细胞存活率为100%，计算其余各组的细胞存活率。

细胞存活率＝（A实验－A空白）/（A对照－A空白）

2.6ELISA检测细胞上清液中炎症因子水平

将RAW 264.7细胞以每孔1×105个接种于6孔板中，每孔加入2 mL完全培养基，置于37 ℃、5% CO₂培养箱中培养24 h（待细胞贴壁）。弃去各孔上层培养基后进行分组处理：对照组加入2 mL不含LPS及药物的完全培养基，模型加入2 mL含1 μg·mL−1 LPS的完全培养基，药物处理组加入2 mL含1 μg·mL−1 LPS及对应质量浓度药物的完全培养基（药物质量浓度分别为100、200、400 μg·mL−1）。各组继续在相同培养条件下孵育24 h后，收集细胞上清液，采用IL-6和TNF-α检测试剂盒测定上清液中2种细胞因子的含量。

3结果

3.1质谱法对两种黄精化学成分的差异分析

九制黄精及生黄精的总离子流（TIC）图见图1。两种黄精共检测到114种化学成分，其中82种成分为两种黄精共有，21种成分仅存在于九制黄精中，11种成分仅存在于生黄精中，说明黄精经过炮制加工后，其化学成分会发生明显变化。由此可知，九制黄精的化学反应会随着其加工过程而发生变化，导致其化学成分与生黄精的化学成分有较大差异，具体差异情况见表2。

3.2 PCA

分析结果显示（图2），第1主成分的方差贡献率为56.7%，第2主成分的方差贡献率为38.1%，前2个主成分的累积方差贡献率达94.8%，可较好反映样本整体差异。图2中箭头分别对应表2所检测到的黄精化学成分差异，由图可见，九制黄精的独有成分主要包括生物碱类（5-羟基吡啶-2-甲酸甲酯）、挥发油类（thymol）、苯丙素类（皮树脂醇）；而生黄精的独有成分则以氨基酸类（丝氨酸）和甾体皂苷类（liriodendrin B）为主。

上述结果揭示了九制黄精与生黄精在化学成分构成上的显著差异，这种差异可能导致二者药理作用的偏向性不同。例如，九制黄精较生黄精含有更多生物碱（如N-feruloyloctopamin）及挥发油成分（如thymol[19]、salvinori[20]），这些成分已被证实具有显著抗炎活性，其作用机制可能与抑制核因子-κB（NF-κB）、转导和转录激活因子（STAT3）等炎症信号通路，下调IL-6、TNF-α等促炎因子表达相关。此外，苯丙素类成分可能通过调控磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/蛋白激酶B（Akt）信号轴增强免疫细胞功能。

3.3网络药理学结果

基于UPLC-Q-TOF-MS/MS分析得到的九制黄精成分，通过TCMSP数据库筛选后共获得88种成分；利用Swiss Target Prediction数据库对这些成分进行靶点预测，经去除重复靶点后得到946个成分相关靶点。在GeneCards、NCBI、OMIM数据库中检索炎症相关靶点，整合去重后获得16 208个炎症疾病靶点。取成分靶点与炎症靶点的交集，得到873个共同靶点，推测其可能是九制黄精治疗炎症的潜在靶点（图3），将91个活性成分与873个交集靶点导入Cytoscape 3.9.1软件构建PPI网络图见图4。采用Network analyzer功能，得到度值排名前5的活性成分，分别是延龄草苷（diosgenin glucoside）、N-阿魏酰真胺（N-feruloyltrueamine）、麝香草酚（thymol）、丁香脂素（syringaresinol）、静特诺皂苷元（gentrogenin）。GO分析结果按照−lgP值排序并筛选出前10的条目。如图5所示，九制黄精治疗炎症的潜在靶点在生物过程（BP）上与protein phosphorylation（蛋白磷酸化）、phosphorylation（磷酸化）、negative regulation of apoptotic process（凋亡过程负调控）等相关；在细胞组分（CC）上与plasma membrane（细胞膜）、cytoplasm（细胞质）、extracellular exosome（细胞外囊泡）、receptor complex（受体复合物）等相关；分子功能（MF）上与protein serine（蛋白丝氨酸）/threonine（苏氨酸）/tyrosine kinase activity（酪氨酸激酶活性）、identical protein binding（相同的蛋白质结合）、protein kinase activity（蛋白激酶活性）、protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶）等相关。KEGG通路富集结果按富集值≥1.5、基因重叠数≥3、P＜0.01进行筛选，再根据−lgP值及通路关联基因数量排序，选取前20条通路。结果显示，这些通路主要包括神经活性配体-受体相互作用、高级糖基化终末产物-受体（AGE-RAGE）信号通路及PI3K-Akt信号通路等（图6）。

3.4活性成分与核心靶点的分子对接

选定的度值排名前5种的核心成分延龄草苷、N-阿魏酰真胺蛸胺、麝香草酚、丁香脂素、静特诺皂苷元与PPI网络中排名前6的核心蛋白信号：转导和转录激活因子（STAT3）、蛋白激酶Bα（AKT1）、缺氧诱导因子1亚基α（HIF1A）、肿瘤坏死因子（TNF）、白细胞介素-6（IL-6）和B细胞淋巴瘤/白血病-2基因（BCL2）进行分子对接。结合能小于0kJ·mol−1表示自发结合，结合能小于−20.95 kJ·mol−1表示结合良好，小于−29.33 kJ·mol−1表明结合活性强（表3）。核心成分与蛋白受体的结合能均小于0，表明成分与受体的直接结合良好，网络药理学结果可信度高。部分成分与靶蛋白的对接结果如图7所示。从靶标水平看STAT3、AKT1、HIF1A、TNF、IL6、BCL2 6个具有较强的结合力，可以推测这6个靶标是黄精治疗炎症的关键靶标，从化学成分水平看延龄草苷、麝香草酚、静特诺皂苷元的结合力最强，说明这3种成分是九制黄精中的关键活性成分。结合文献调查可知，这些成分和靶点与炎症、细胞凋亡等有关。

3.5RPA和NPA对RAW 264.7细胞增殖的影响

如图8所示，与对照组相比，1～400μg·mL−1的RPA和NPA对RAW 264.7细胞增殖没有显著影响。当RPA质量浓度达到800 μg·mL−1时细胞活性呈下降趋势，为避免药物浓度过高对细胞活性产生非特异性影响而干扰实验结果，后续实验选择100、200、400 μg·mL−1作为实验浓度。

3.6RPA和NPA对LPS诱导RAW 264.7细胞分泌炎症因子TNF-α和IL-6的影响

结果如图9所示。与对照组相比，模型组细胞分泌TNF-α和IL-6的水平显著升高（P＜0.01）；与模型组相比，NPA和RPA均能显著抑制LPS诱导的TNF-α与IL-6分泌。相同质量浓度（400 μg·mL−1）下，RPA组的TNF-α水平较NPA组更低；而各质量浓度下，RPA组的IL-6分泌量均高于NPA组（P＜0.01）。