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你见过植物F1群体做GWAS关联分析？？速看这篇一区7分好文

来源：花匠小妙招时间：2024-10-12 13:33

全基因组关联分析(genome wide association study, GWAS) 是以连锁不平衡（linkage disequilibrium）为基础的鉴定群体中控制目标性状的功能基因以及挖掘功能位点的分析方法。一般采用自然群体为材料，优势在于无需繁琐构建遗传分离群体，具有广泛的变异，发生的重组为历史重组，其定位精度可以大大提高。

但是近期一篇利用杂交F1代进行菊花抗病性状GWAS研究的文章被小编发现了，下面我们一起来看看这篇文章是怎样利用杂交F1代进行GWAS研究的，且发表在园艺研究上。

// 原文标题：

A genome-wide association and fine-mapping study of white rust resistance in hexaploid chrysanthemum cultivars with a wild diploid reference genome

译名：具有野生二倍体参考基因组的六倍体菊花品种抗白锈病的全基因组关联及精细定位研究

发表期刊：Horticulture Research

IF：7.291

发表时间：2022.8

作者单位：

Institute of V egetable and Floriculture Science, NARO, Tsukuba, Ibaraki 305-0852, Japan

文章链接：

https://doi.org/10.1093/hr/uhac170

研究背景

菊花(Chrysanthemum × morifolium Ramat.)是世界上重要的观赏作物。由Puccinia horiana引起的白锈病是菊花最严重的病害之一，对商业生产造成了重大的经济损失。因此，开发抗性相关的DNA标记将有助于高效的抗性育种。

到目前为止，白锈病的DNA标记开发一直具有挑战性，因为菊花是一种高度杂合的异交六倍体物种，有许多染色体(2n = 6x = 54)，这使其遗传分析、DNA标记开发和全基因组组装一直是研究难点。

利用C. seticuspe的基因组序列作为参考，从六倍体栽培菊花的ddRAD-Seq数据中挖掘DNA多态性，前期研究已报道与抗性遗传位点Phr1相关的DNA标记。根据基因对基因的相互作用，植物已经进化出了复杂的对抗病原体的抗性系统，而病原体则进化出了规避这些植物抗性系统的功能。通过这些相互作用，植物获得了许多抗性基因。根据这一理论，菊花可能获得了多个抗白锈病基因。本研究旨在开发一种新型的白锈病抗性位点有助于标记辅助选择育种和抗性检测。

材料与方法

01ddRAD-Seq+GWAS:“Ariesu”×“Yellow Queen”的64株F1+“Yellow Queen”×“Ariesu”的219株F1+父母本（Ariesu+Yellow Queen）

参考基因组：野生二倍体菊花基因组（CSE_r1.0）

02Ariesu、Yellow Queen全基因组测序

03另一个从“Yellow Queen”×“Ariesu”获得的F1群体(n = 373)用于精细定位分析

04以抗性中小轮品系(Kyura Shusa、 Moze Cute、SEI01、SEI02、SEI03) 为花粉亲本，与Yellow Queen杂交，分别得到54、44、36、50和48（共232个） F1用于SNP标记抗性关联分析

05PCR实验验证

全基因组关联研究和全基因组测序相结合开发栽培菊花SNP标记和Phr2位点精细定位

结果

Ariesu对P . horiana抗性研究

利用接种试验研究了 Ariesu 和 Yellow Queen 对P . horiana菌株的反应。Ariesu对6个分离株( TS、AK、IB、TO1、TO2和TO3)表现出抗性，但对NA敏感。Yellow Queen对所有分离株均表现出敏感性。在双亲互交的283个F1个体对P . horiana分离株TS的反应中，抗：感比例为145：138。这一结果与单倍体×无显性组合( Aaaaaa × aaaaaa)杂交后代六倍体遗传1：1 ( χ2 = 0.17 ; p = 0.68)的预期比例接近，遵循菊花分离模式。从F1群体中挑选8个抗性和8个感病个体分离TS，用另外6个分离株进行接种试验。对TS表现抗性的8个单株对AK、IB、TO1、TO2和TO3也表现抗性，但对NA (表1 ;附图S1)表现感病。互作表型与Ariesu一致。相比之下，所有对TS敏感的8个个体对其他6个分离物也表现出敏感性。这些结果表明Ariesu 有一个单一的显性遗传位点，即Phr2，对6株分离菌株有效。

接种P . horiana35天的抗性品种Ariesu和感性品种Yellow Queen叶片

8个抗性和8个感病F1个体分离TS，用另外6个分离株进行接种试验

“Ariesu”中的P.horiana抗性GWAS和连锁分析

对双亲互交F1群体（n=283）及双亲进行ddRAD测序开发标记，GWAS分析中82个SNP标记与P.horiana抗性显著相关。其中SNP标记SCSE_SC004884.1_65872的相关性最高（p值为1.12×10-113），基因型为TTTTTC，其在感性Yellow Queen 的基因型为TTTTTT。SCSE_SC000716.1_75925标记相关性倒数第二（p值为2.76×10-106），基因型分别为Ariesu的AAAAAG和Yellow Queen的AAAAAA。

SCSE_SC004884.1_65872的小C等位基因和SCSE_SC000716.1_75925的小G等位基因处于Phr2抗性等位基因的耦合阶段。

283个Ariesu与Yellow Queen互交F1植株的标记基因型与抗性的关系

比较Ariesu和Yellow Queen全基因组序列进行精细映射

为了获得与Phr2位点紧密相连的标记，作者分析了SCSE_SC004884.1_65872和SCSE_SC000716.1_75925这两个标记之间的基因组区域序列。连锁分析表明Phr2与SCSE_SC004884.1_65872的遗传距离为1.4 cM，与SCSE_SC000716.1_75925的遗传距离为2.1 cM。栽培菊花基因组尚未阐明，所以两个SNP标记之间的序列尚不清楚。作者讨论了利用野生二倍体C. seticuspe pseudomolecule作为栽培菊花参考基因组，两个标记定位在C. seticuspe pseudomolecule的第9号染色体上，该区域的物理间隔约为7.4 Mbp（SCSE_SC004884.1_65872到SCSE_SC000716.1_75925: 44,717,622-52,150,792 bp）。

对Ariesu和Yellow Queen进行全基因组重测序以组装基因组，Ariesu的总长度和N50长度分别为21,001,896,460和203 bp，Yellow Queen的总长度和N50长度分别为20,449,854,573和203 bp。分别选择了3,743,825和3,521,557个Ariesu和Yellow Queen大小为>500 bp的contigs将其映射到C. seticuspe pseudomolecule上，最终得到Ariesu和Yellow Queen的不连续基因组序列。

精细定位

在C. seticuspe pseudomolecule 9号染色体46.1—50.0 Mbp区域，每0.5 Mbp设计8个SNP标记。这些SNP标记被用来更精确地划分Phr2位点。在656个F1植株中，鉴定出20个F1重组植株，在SCSE_SC004884.1_65872和SCSE_SC000716.1_75925之间发生了遗传重组。随后，利用这8个SNP标记对这20株植物的基因型进行分析。将Phr2位点缩小到SNP标记Cse2.0_LG9_46170750T, Cse2.0_LG9_46476925C and Cse2.0_LG9_49032201A之间0.7 cM的遗传区间。Ariesu 中这些标记之间的潜在区域应该包含抗性基因，并且对应于C. seticuspe pseudomolecule 9号染色体上约2.6 Mbp (Cse2.0_LG9_46476925C到Cse2.0_LG9_49032201A: 46,476,925 - 49,032201 bp)的区域。

标记抗性检测

4个SNP标记(Cse2.0_LG9_47009004G、Cse2.0_LG9_47483611T、Cse2.0_LG9_48084985C和Cse2.0_LG9_48453417A)在656 F1后代中与Phr2共分离(图C)，表明它们与Phr2存在连锁不平衡，可以在菊花遗传资源中识别出具有Phr2抗性相关基因的品种。为了评估可转移性，在46个品种中测试了与7个P . horiana分离菌株抗性的相关性。这7个分离株在46个栽培品种上没有表现出相同的感染情况，表明它们各自代表不同的致病型。TS感染的品种最多(25/46)。NA和TO2也分别侵染了22和21个品种。TO3感染的品种最少(13/46)。7个分离株与至少3个栽培品种表现出非冗余侵染互作。

在5个携带Phr2相关SNP抗性等位基因的抗性品种后代中研究标记-抗性关联：Kyura Shusa、Moze Cute 、 SEI01 、SEI02 、 SEI03。通过与感性品种Yellow Queen 杂交获得F1群体，利用TS分离物进行接种试验和PCR分析，鉴定代表性的Cse2.0 _ LG9 _ 48084985C SNP标记。在Kyura Shusa 、SEI01 、SEI02衍生的F1群体中，抗性和感病性的近1：1分离，以及对TS分离株的抗性，与SNP标记Cse2.0 _ LG9 _ 48084985C上抗性C等位基因的存在一致。结果表明，这些品种中存在标记-抗性关联，证实SNP标记可用于检测抗性。

Moze Cute和SEI03的结果验证了SNP标记Cse2.0 _ LG9 _ 48084985C可以作为区分Phr2的分子标记。

结论

本研究利用283个抗性“Ariesu”和易感“Yellow Queen”互交的F1群体进行dd-RAD测序开发分子标记。通过GWAS分析确定了抗性品种“Ariesu”基因组P. horiana抗性基因座 2 ( Phr2 ) 的重要区域。对两个品种进行重测序组装基因组序列，虽然通过短读长方法组装的菊花品种基因组序列是片段化的，但通过映射到野生二倍体菊C. seticuspe假分子的染色体水平上重建了可靠的基因组比对，对 Phr2进行精细定位。这些SNP标记与抗性“Ariesu”F1后代的抗性共分离，在检测菊花遗传资源中phr2介导的抗性时表现出良好的转移性。野生C. seticuspe假分子是一种事实上的单倍体基因组，虽然组装的栽培菊花基因组序列碎片严重，但通过将其定位到C. seticuspe假分子上，可以很好地重建DNA标记。结果表明，该方法可为菊花品种DNA标记的开发提供模型。

小编总结

本研究利用F1群体简化测序开发标记，结合连锁分析和关联分析两种方法进行性状定位，一步步精细定位，环环相扣，且为多倍体无本身参考基因组的物种提供了一种新组装基因组序列简单思路，可作为其DNA标记开发的模型。

目前已经发表的菊花GWAS文章（见下表）：