关于水稻调节因子HDR1与激酶OsK4联合控制光周期开花的探讨

在阅读此文之前，麻烦您点击一下“关注”，既方便您进行讨论和分享，又能给您带来不一样的参与感，感谢您的支持。

文七爷

编辑七街酒舍

前言

水稻是一种兼性短日照植物（SDP），拟南芥和水稻的开花时间调控途径是保守的，但在功能上进行了修改。

抽穗日期1(Hd1)是拟南芥CONSTANS(CO)的直系同源物，是一个关键的调控因子，在长日照条件(LD)下抑制开花，但通过影响成花素的表达在短日照条件(SD)下促进开花。

基因标题日期3a(Hd3a)。另一个关键调节因子，早期抽穗日期1(Ehd1)，是拟南芥中一个进化上独特的基因，没有直系同源基因，它通过促进水稻成花基因Hd3a和RICEFLOWERING LOCUST1(RFT1)在SD和LD下充当开花激活剂。在这里，研究报告了水稻中开花调节因子HeadingDateRepressor1(HDR1)的分离和表征。

hdr突变体在中国北京的稻田（39°54'N，116°23'E）的自然LD下表现出早花表型，在生长室中的LD但非SD下也表现出早期开花表型，表明HDR1可能通过光周期依赖性途径功能性调节开花时间。

HDR1编码一种在叶子和花器官中最活跃的核蛋白，并表现出典型的昼夜表达模式。研究确定HDR1是一种新型的开花抑制因子，它上调Hd1并下调Ehd1，从而导致LD下Hd3a和RFT1的下调。

我们进一步鉴定了一种HDR1相互作用激酶OsK4，它是LD下水稻开花的另一种抑制因子。OsK4的作用与HDR1类似，在LD下通过上调Hd1和下调Ehd1来抑制开花，并且OsK4可以在HDR1存在的情况下磷酸化HD1。这些结果共同揭示了Hd1的转录调节因子用于水稻开花时间的日长依赖性控制。

一、早花突变体hdr1的鉴定和表征

研究之前报道过T-DNA诱变水稻群体的发展和特征 。

在转化过程中，平均有2.8个拷贝的T-DNA和2.1个新转座的Tos17拷贝被整合到水稻基因组中。突变体群体的系统表征导致早花和晚花突变体的鉴定，并且突变体中T-DNA/Tos17插入位点侧翼的序列被扩增 。

一种名为hdr1的突变体在NLD下生长后，比野生型（WT，Oryzasativavar.Nipponbare）植物早开花约30天中国北京的一片稻田（北纬39°54'，东经116°23'）。

WT和hdr1植物的表型在北京自然日田间条件(ND)和LD（14小时光照/10小时黑暗）和SD（10小时光照/14小时黑暗）条件下进行评估。受控生长室。在ND和LD下，hdr1植物比WT植物早开花约30天，而在SD下没有观察到显著差异。这些数据表明HDR1可能参与水稻光周期开花的调节。

二、HDR1控制水稻的光周期开花

为了验证观察到的早期开花表型是由HDR1的破坏引起的，使用基因组DNA构建体进行了互补实验，该构建体包括HDR1的启动子、编码和终止子区域以及由HDR1驱动的全长HDR1cDNA构建体。HDR1启动子。总共获得并通过PCR确认了204个阳性T0系（69个系用于基因组构建体，135个系用于全长cDNA构建体）。

其中，142个品系（44个用于基因组构建体，98个用于cDNA 构建体）的开花时间比hdr1晚 20-28 天，与WT类似（在中国北京的稻田中）。在这些品系中，有30个互补品系时间随机选择1株植物（15株用于基因组构建体，15株用于cDNA构建体）以产生纯合体植物用于进一步分析；与野生型植物相比，这些植物表现出正常的开花时间。

随后在不同光周期下测量WT、hdr1和补充植物的开花时间。hdr1植物比WT早开花约4周，并在自然生长季节（中国北京）期间补充了LD（14小时光照/10小时黑暗）下的植物。在SD下还观察到开花稍早。

这些数据表明，两种构建体完全补充了突变体的早期开花表型。

三、HDR1编码具有昼夜表达模式的核蛋白

水稻中的HDR1编码PpSKI的直系同源物，PpSKI是苔藓中假定的激酶配体 。HDR1样蛋白在单子叶植物、双子叶植物和苔藓中普遍存在，这意味着这种蛋白具有古老的起源。

随后的系统发育分析揭示了单子叶植物（例如水稻、玉米、高粱、大麦、小米和小麦）、双子叶植物（例如大豆、鹰嘴豆、葡萄、黄瓜、番茄、马铃薯、西瓜、杏仁树、油菜、苹果树和拟南芥），以及苔藓和蕨类植物（分别为立碗藓和卷柏）。

毛足亚纲HDR1的同源物形成了一个与其独特的开花植物进化谱系一致的单一进化枝，该进化谱系很早就（约1.3亿年前）与所有其他现存的开花植物物种分歧。研究还注意到，HDR1样家族的C末端在不同物种中高度保守。

四、HDR1充当Hd1的上游激活子和Ehd1的抑制子

与LD下而非SD下的WT相比， hdr1的早期开花与先前描述的Hd1敲低突变体和Ehd1过表达植物的表型相似。Hd1和Ehd1是控制水稻开花的网络的两个关键部分；

因此，在LD和SD条件下研究了WT和hdr1植物中的Hd1和Ehd1表达。Hd1节律性表达显着降低，而Ehd1与WT植物相比，在LDs下hdr1的表达显着增加，但在SDs下没有显着增加。

这些结果表明HDR1可能参与Hd1和Ehd1途径来控制LDs下水稻的开花时间。先前的工作表明Hd1可以抑制Ehd1的表达；因此，Ehd1的下调可能是由于Hd1转录的改变所致。

植物中Hd1的非功能性等位基因的表达或Hd1的低水平表达会导致成花基因Hd3a的高水平表达，表明Hd1抑制Hd3a的表达并延迟LD下的开花，而Ehd1则增加Hd3a和RFT1表达可促进 LD下的开花。

确认hdr1中Hd1表达的减少和Ehd1表达的增加是否是Hd3a上调的原因和RFT1以及随后促进水稻开花，检查了突变体和WT植物中Hd3a和RFT1的节律表达模式。在SD下，hdr1和WT之间的Hd3a和RFT1表达保持不变。

然而，与WT中的水平相比， Hd3a和RFT1表达在光照下显着增加，而在黑暗中在LD下保持在低水平。这些结果与两个FT样基因Hd3a和RFT的结论一致。确保水稻在LD下开花。

五、HDR1和OsK4蛋白形成核复合物

HDR1编码苔藓中SNF1/AMPK/SnRK1激酶PpSKI配体的同源物。已在植物中鉴定出属于SnRK家族的几种激酶基因，包括拟南芥和水稻 。筛选了由不同发育阶段的叶和花组织组成的酵母双杂交(Y2H)文库，以鉴定水稻中HDR1的相互作用激酶。使用HDR1作为诱饵，鉴定出了许多相互作用蛋白的多个独立片段。

其中，分离并测序了5个满足与HDR1相互作用标准的独立克隆。这5个克隆的不同序列匹配为OsK4基因（LOC_Os08 g37800[TIGR]）。水稻基因组中也存在一种与OsK4相似度为97.84%的蛋白质，名为OsK3(Os03g0289100[TIGR])。

首先，进行了酵母双杂交测定，以确认OsK4和OsK3与HDR1的直接相互作用。事实上，OsK4和OsK3都直接与HDR1相互作用。

还进行了详细的测定，以阐明HDR1的不同外显子在Y2H系统中与OsK4相互作用中的作用，结果表明，外显子1和外显子2（而非外显子3）与OsK4强烈相互作用。鉴于HDR1C末端的进化保守性，这些数据表明 HDR1N末端对于与OsK4相互作用非常重要。

此外，我们还注意到hdr1表现出较晚的萌发，与报道的osk3和osk4突变体相似（S6图和 ）。

六、OsK4的作用与HDR1类似，可抑制开花

为了研究OsK4在水稻开花中的功能，我们生成了OsK4-和OsK3-RNAi植物。 RNAi株系首先使用GUS活性测定进行鉴定（载体pTCK309含有由T边界内的35S启动子衍生的β-葡萄糖醛酸酶（GUS）基因，这使得可以方便地鉴定转基因植物），然后通过qPCR进行确认。

OsK4-RNAi品系比WT早大约2周开花，而在OsK3-RNAi品系中没有观察到早期开花植物(图6B和6C)。进一步构建了hdr1OsK4-RNAi双突变体，发现其在LD中与hdr1突变体相似地开花。

hdr1和OsK4-RNAi植物的早期开花以及HDR1和OsK4之间的相互作用提出了一个问题：涉及HDR1和OsK4的类似调控途径是否在LD条件下的水稻中发挥作用。

在LD和SD下进行qPCR分析，但仅在LD下检测到Ehd1的上调和Hd1的下调，证实OsK4表现出与HDR1相同的调节模式。同样，Ehd1的增加和Hd1的急剧下降导致成花素RFT1和仅在LD下观察到Hd3a。

七、OsK4与HDR1相关，具有磷酸化HD1的功能

为了阐明HDR1和OsK4之间的关系，我们首先分析了OsK4和HDR1在hdr1或OsK4-RNAi转基因植物中的定位和表达。

根据之前的报道，在hdr1中，OsK4-GFP融合蛋白定位于细胞核。为了研究HDR1功能缺失是否影响OsK4蛋白水平，研究进行了蛋白质印迹法来测量hdr1和WT中的OsK4蛋白水平，发现OsK4水平没有差异。

使用两个转基因系来确定HDR1-GFP融合蛋白的位置。HDR1专门定位于细胞核，如WT中那样。有趣的是，OsK4-RNAi植物中HDR1蛋白水平显着降低。

Osk4-RNAi品系中的低HDR1水平可能是由于低HDR1所致；因此，我们检查了WT和OsK4-RNAi系中HDR1基因的节律表达模式。OsK4-RNAi中HDR1的表达节律没有改变。研究还发现HDR1的过度表达可以挽救OsK4-RNAi植物的早期开花表型。

鉴于我们发现HDR1和OsK4并不直接与HD1或EHD1相互作用，但HDR1作为Hd1和Ehd1的上游调节因子，并且可以与OsK4形成复合物，之后探索了HDR1之间物理相互作用的可能性-OsK4和HD1或EHD1。

研究进行了Y3H测定，其中HD1或EHD1融合到GAL4激活结构域(AD)，OsK4融合到GAL4 结合结构域(BD)以及HDR1共表达。事实上，HDR1和OsK4一起可以与HD1相互作用，而不是EHD1。

为了进一步验证HDR1和OsK4与HD1相互作用，进行了Co-IP测定。发现当FLAG-HDR1和OsK4一起输入时，HDR1和OsK4有效沉淀HD1，表明HD1是HDR1-OsK4复合物的一部分。

结论

在本研究中，发现HDR1与OsK4激酶蛋白相互作用，并且通过调节Hd1和Ehd1的表达，导致Hd3a和RFT1在LD下下调，从而对于抑制开花至关重要。进一步确定OsK4和HDR1可以磷酸化HD1。这些发现共同说明了HDR1和OsK4复合物在通过HD1调节开花时间的日长中的重要作用。

参考文献：1.FornaraF、deMontaiguA、CouplandG。快照：拟南芥开花的控制。细胞。 2010；141：550.e1-2。
2.Li F，Sun J，WangD，BaiS，ClarkeAK，HolmM。拟南芥中的B-Box家族基因STO(BBX24)通过不同途径调节开花时间。2014；9：e87544。
3.TakahashiY 、TeshimaKM、YokoiS、InnanH、ShimamotoK。Hd1蛋白、Hd3a启动子和Ehd1表达水平的变化有助于栽培稻开花时间的多样性。2009；106：4555–4560。
4.TurckF、FornaraF、CouplandG。成花素的调控和特性：开花轨迹T占据中心舞台。2008；59：573-594。
5.NonoueY，FujinoK，HirayamaY，YamanouchiU，LinSY，YanoM。控制水稻极早期抽穗的数量性状基因座的检测。 2008；116：715–722。
6.Suárez-LópezP、WheatleyK、RobsonF、OnouchiH、ValverdeF、CouplandG。CONSTANS在拟南芥中的昼夜节律钟和开花控制之间发挥作用。 2001；410：1116-1120。

相关知识

水稻开花时间决定的光周期途径分子调控机制研究进展
水稻光周期开花成花素基因相关研究
CONSTANS是一种光周期调控的高粱开花激活因子
调节植物响应光周期开花的分子机制阐明
重磅综述：水稻开花时间的环境信号依赖性调控
植物的营养与光周期的调节.pptx
植物的光周期调节与节律.pptx
中科院华南植物园揭示光周期以CONSTANS依赖的方式控制植物种子大小
植物的光周期调控与开花.pptx
亮点解读| 类受体激酶——植物环境适应性的调节枢纽

网址: 关于水稻调节因子HDR1与激酶OsK4联合控制光周期开花的探讨 https://www.huajiangbk.com/newsview2465005.html