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ABA介导的PacMYBA调控红肉甜樱桃果实花色苷合成的研究

来源：花匠小妙招时间：2025-10-28 13:49

学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示作　者: 沈欣杰
导　师: 李天红
学　校: 中国农业大学
专　业: 果树学
关键词: 甜樱桃花色苷 PacMYBA ABA VIGS
分类号: S662.5
类　型: 博士论文
年　份: 2014年
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内容摘要

植物中的花色苷属于水溶性色素,在果实和蔬菜中主要呈现出蓝色,紫色和红色。植物花色苷合成路径属于苯丙氨酸解氨酶途径中的类黄酮分支。近期研究表明,一类R2R3-MYB转录因子对花色苷合成具有显著地调控作用。本研究在分析了甜樱桃果实发育动态及相关生理指标变化的基础上,克隆了甜樱桃果实花色苷合成路径关键酶基因和R2R3-MYB转录因子,开展了甜樱桃花色苷合成和调控机制的研究,主要研究结果如下：(1)对甜樱桃果实发育做了果实发育动态及生理指标分析。发现甜樱桃果实发育呈现典型的双“s”动态发育过程。果实可溶性糖包括葡萄糖,果糖和山梨醇,蔗糖未检出。果实叶绿素含量在小绿果时期后呈现下降趋势,而花色苷含量在转色期后迅速增加。(2)首次利用RACE技术克隆得到甜樱桃花色苷合成路径5个关键酶基因全长序列和部分CHS基因序列,依次命名为：PacCHS, PacCHI, PacF3H, PacDFR, PacANS, PacUFGT。 qRT-PCR分析表明,在甜樱桃果实发育前期PacCHS, PacCHI和PacF3H表达水平逐渐升高,果实转色期后表达量迅速下降,临近成熟又快速提高。而PacDFR, PacANS和PacUFGT则在果实发育前期一直较低的表达水平,在果实转色期后则逐渐上升并且维持在一个较高的表达水平。(3)克隆得到甜樱R2R3-MYB类转录因子命名为PacMYBA。蛋白序列比对发现PacMYBA与已知的花色苷调控相关的转录因子MdMYB10在R2R3区域相似度达到84%,全蛋白序列相似率达到68%。亚细胞定位发现PacMYBA定位于细胞核中,且没有转录自激活活性。组织特异性表达分析表明PacMYBA在成熟的果皮和果肉中表达量最高。在甜樱桃果实发育进程中PacMYBA的表达与果实花色苷积累呈现显著相关。在PacMYBA启动子中发现了多个参与植物生长发育响应、逆境响应和植物激素响应的顺式作用元件。(4)在模式植物拟南芥中过表达PacMYBA,转基因植株授粉后10d内荚果果皮变红,而野生型植株荚果依然为绿色,表明PacMYBA具有调控花色苷合成的作用。应用病毒介导的基因沉默手段(VIGS)成功地沉默了发育果实中的PacMYBA,注射含有PacMYBA-TRV2和TRV1的樱桃果实相对于注射空TRV载体果实没有正常地积累花色苷物质,说明PacMYBA直接参与调控了甜樱桃果实花色苷物质的合成。(5)转色期前外源施用ABA可以显著促进樱桃果实花色苷的合成,ABA生物合成抑制剂NDGA处理则显著抑制了果实花色苷的合成,说明外源施加ABA对果实花色苷的合成具有促进作用。用30μmol/L ABA温育溶液处理甜樱桃果实圆片,PacMYBA表达量迅速升高,处理后1h即显著高于对照；用NDGA处理后PacMYBA表达量始终低于对照和ABA处理,表明PacMYBA的表达可能受ABA调控.用VIGS技术沉默ABA生物合成途径中关键酶基因PacNCEDl可以降低甜樱桃果实内源ABA含量,且显著抑制了甜樱桃果实花色苷的合成。6个花色苷合成路径关键酶基因和PacMYBA的相对表达量在PacNCED1-RNAi果实中显著低于TRV空载体和对照果实。这进一步说明ABA作为一种信号分子参与了甜樱桃果实花色苷的合成。

全文目录

摘要  4-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
縮略语表  10-12
第一章文献综述  12-22
  1.1 植物中的花色苷  12
  1.2 花色苷合成途径中主要的关键酶基因  12-16
    1.2.1 查尔酮合成酶(CHS)  14
    1.2.2 查尔酮异构酶(CHI)  14
    1.2.3 黄烷酮3-羟化酶(F3H)  14-15
    1.2.4 二氢黄酮醇还原酶(DFR)  15
    1.2.5 花色苷合成酶(ANS)  15
    1.2.6 类黄酮葡萄糖基转移酶(UFGT)  15-16
  1.3 影响植物花色苷合成的环境和遗传因素  16-18
    1.3.1 自然环境因素对花色苷合成的影响  16
    1.3.2 花色苷合成的遗传因素  16-18
  1.4 高等植物中ABA的合成及作用  18-20
    1.4.1 高等植物ABA生物合成代谢研究进展  18-19
    1.4.2 果实成熟衰老过程中内源ABA的变化规律  19-20
  1.5 研究目的和意义  20-22
第二章甜樱桃果实发育动态及花色苷合成关键酶基因克隆  22-34
  摘要  22
  Abstract  22-23
  引言  23
  2.1 试验材料  23-24
    2.1.1 植物材料的培养及处理  23
    2.1.2 主要仪器  23-24
    2.1.3 各种酶及试剂  24
  2.2 试验方法  24-29
    2.2.1 甜樱桃果实果重及纵横径的测定  24
    2.2.2 甜樱桃可溶性糖的测定  24
    2.2.3 甜樱桃果实叶绿素的测定  24
    2.2.4 甜樱桃果实花色苷的测定  24
    2.2.5 甜樱桃果实内源激素ABA和IAA的测定  24-25
    2.2.6 总RNA的提取和纯化  25
    2.2.7 cDNA的合成  25
    2.2.8 花色苷合成路径基因全长序列克隆及序列分析  25-26
    2.2.9 纯化产物的回收及测序  26-28
    2.2.10 实时荧光定量表达分析  28-29
  2.3 结果与分析  29-32
    2.3.1 甜樱桃果实发育过程中纵横径,果色及单果重变化  29
    2.3.2 甜樱桃果实发育过程中花色苷,叶绿素,可溶性糖含量的变化  29-30
    2.3.3 甜樱桃果实发育过程中ABA和IAA含量的变化  30
    2.3.4 甜樱桃花色苷合成路径关键酶基因的克隆  30-31
    2.3.5 甜樱桃果实发育过程中花色苷合成路径关键酶基因的表达模式  31-32
  2.4 讨论  32-34
第三章 PacMYBA转录因子特性和功能的研究  34-65
  摘要  34
  Abstract  34-35
  引言  35-36
  3.1 试验材料  36-37
    3.1.1 试验材料  36
    3.1.2 菌体材料及载体  36-37
    3.1.3 主要仪器  37
    3.1.4 各种酶及试剂  37
  3.2 试验方法  37-50
    3.2.1 总RNA和DNA的提取和纯化  37
    3.2.2 cDNA的合成  37
    3.2.3 PacMYBA基因全长序列克隆及序列分析  37-38
    3.2.4 PacMYBA启动子序列的克隆  38-40
    3.2.5 PacMYBA亚细胞定位载体构建  40-41
    3.2.6 酵母自激活载体构建  41-42
    3.2.7 PacMYBA拟南芥原生质体亚细胞定位  42-43
    3.2.8 PacMYBA转录激活活性鉴定  43-44
    3.2.9 PacMYBA基因全长克隆、亚细胞定位和酵母自激活试验载体构建引物设计  44
    3.2.10 实时荧光定量PCR  44
    3.2.11 PacMYBA转基因拟南芥载体和TRV病毒的构建  44-46
    3.2.12 农杆菌法转拟南芥  46-47
    3.2.13 TRV病毒侵染甜樱桃果实的可行性分析  47
    3.2.14 PCR验转基因植株阳性苗  47-48
    3.2.15 甜樱桃果实花色苷物质的检测  48
    3.2.16 pGreen Ⅱ0029-62-SK系列载体的构建  48
    3.2.17 pGreen Ⅱ0800-LUC系列载体的构建  48-49
    3.2.18 农杆菌GV3101介导的烟草瞬时转化  49-50
  3.3 结果与分析  50-63
    3.3.1 甜樱桃PacMYBA基因的分离及序列分析  50-53
    3.3.2 PacMYBA原生质体亚细胞定位及转录激活鉴定  53-54
    3.3.3 PacMYBA组织特异性表达模式  54-55
    3.3.4 PacMYBA在甜樱桃果实发育过程中的表达情况  55-56
    3.3.5 PacMYBA基因启动子的克隆及顺势元件分析  56
    3.3.6 PacMYBA转基因拟南芥植株的表型分析  56-58
    3.3.7 PacMYBA参与调控甜樱桃果实花色苷合成调控  58-59
    3.3.8 PacDFR,PacANS和PacUFGT启动子的克隆及序列分析  59-61
    3.3.9 PacMYBA参与调控了花色苷合成路径关键酶基因启动子的活性  61-63
  3.4 讨论  63-65
    3.4.1 PacMYBA是一个典型的参与调控花色苷合成的R2R3-MYB转录因子  63
    3.4.2 PacMYBA直接参与调控了甜樱桃花色苷物质的合成  63-65
第四章 PacMYBA参与了ABA介导的甜樱桃果实花色苷的合成  65-73
  摘要  65
  Abstract  65
  引言  65-66
  4.1 试验材料  66-67
    4.1.1 植物材料  66
    4.1.2 主要仪器  66
    4.1.3 各种酶及试剂  66-67
  4.2 试验方法  67-68
    4.2.1 总RNA和DNA的提取和纯化  67
    4.2.2 甜樱桃果实ABA和NDGA瓶插处理  67
    4.2.3 ABA和NDGA温育处理甜樱桃果实圆片  67
    4.2.4 PacNCED1-TRV载体的构建  67-68
    4.2.5 农杆菌注射甜樱桃果实  68
    4.2.6 花色苷及叶绿素含量测量  68
    4.2.7 果实ABA及IAA含量测定  68
    4.2.8 实时荧光定量PCR  68
  4.3 结果与分析  68-72
    4.3.1 ABA可以显著促进甜樱桃积累花色苷而NDGA抑制花色苷的合成  68
    4.3.2 PacMYBA可以响应ABA信号  68-70
    4.3.3 沉默PacNCED1可以显著抑制甜樱桃果实花色苷合成,同时下调PacMYBA的表达  70-72
  4.4 讨论  72-73
第五章结论  73-74
参考文献  74-85
致谢  85-86
个人简历  86-87

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中图分类: > 农业科学 > 园艺 > 果树园艺 > 核果类 > 樱桃
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