自发光植物——农杆菌介导的植物花瓣瞬时转化技术及应用

阿凡达2的上映，让我们重温了十四年前那场惊艳世人的璀璨发光世界。回到现实，在地球上也有类似的发光生物，比如海洋里的发光藻，山林里的发光蘑菇，以及小溪边的萤火虫等……只是没有那么绚烂的色彩。自然界中是否存在会发光的植物呢？目前尚无定论。

农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤。根癌农杆菌中含有Ti质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化系统。

基于这套天然的转化系统，我们将挖掘出的真菌自发光通路基因，组装成表达模块，构建载体，利用农杆菌介导的植物瞬时转化技术，经过菌液复苏、制备侵染液、注射植物花瓣（目前较为成熟的转化部位有叶片和花瓣，为增加发光植物的观赏性，我们选择了花瓣进行瞬时转化），成功将其转入植物细胞核内，并行使功能，最终产生了肉眼可见的植物自发光！

一、实验材料与试剂仪器

1. 样品信息

载体、农杆菌、长春花

2. 试剂和耗材

1、LB培养基、Kan抗生素、0.5× PBS缓冲液、AS（乙酰丁香酮）

2、离心管（1.5 mL & 50 mL）、注射器（1 mL）、枪头等

3. 仪器和软件

1、移液枪、离心管架、高速离心机、恒温摇床、超净工作台

2、暗室、单反相机

二、实验操作

农杆菌介导的植物花瓣瞬时转化技术 农杆菌介导的植物花瓣瞬时转化技术

该作品在Bio-protocol第三届生物实验短视频大赛中荣获三等奖，欢迎访问网站查看原视频:https://s.bio-protocol.org/b9fe9cee839cca72

一、 菌种活化

1. 首先准备材料置于超净工作台，取待活化菌液， 用200 μL枪头，搅拌混匀后蘸取菌液，在LB固体培养基表面轻轻划线。用封口膜密封后，转移至28℃恒温培养箱，倒置培养过夜。

2. 次日，在超净台中，向15 mL摇菌管中加入10 mL LB培养液，用200 μL枪头刮取适量培养基表面新生长菌体，连带枪头打入摇菌管。转移至28℃摇床，200 rpm培养过夜。3. 次日，在超净台中，向100 mL三角瓶中倒入50 mL LB培养液，加入1 mL活化的菌液，置于28℃摇床，200 rpm培养过夜。

4. 次日，测量菌液的OD600值，符合要求即可进行下一步实验。

注意：大摇菌液OD600值介于0.8-2.0之间，无杂质沉淀即可。

二、制备侵染液

1. 准备材料置于超净台，向100 mL灭菌的三角瓶中加入78 mL双蒸水，2 mL 20 × PBS缓冲液。颠倒混匀AS试剂后，吸取8 μL AS试剂加入三角瓶中，轻轻摇动混匀，完成配制0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)。

2. 将大摇菌液平均分装于2个50 mL离心管，5,000 rpm离心10分钟，收集菌体。

3. 缓慢移去上清液，加入5 mL配备好的0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)至50 mL离心管中，轻轻吹打混匀。待菌体完全重悬，补加10 mL 0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)，轻轻摇匀。

4. 重复离心操作，5,000 rpm离心10分钟，收集菌体。

5. 缓慢移去上清液，加入5 mL配备好的0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)至50 mL离心管中，轻轻吹打混匀。待菌体完全重悬，补加适量0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)，轻轻摇匀。

6. 测定OD600：取2 mL 0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)作为空白对照，适当补加0.5% PBS溶液（含0.1 mM AS)，至侵染液OD600为0.8左右。

注意：OD600接近0.8时，需小心补加，避免侵染液过稀。

7. 用锡箔纸包裹，暗处理2小时。

三、侵染植物花瓣

1. 用注射器针头在每片花瓣中心轻轻扎孔，用1 mL注射器吸取侵染液，垂直花瓣针口处注射。

注意：缓慢发力，观察水渍情况，待沁润整片花瓣为止，依次注射下一片花瓣。注意操作轻柔，避免损伤花瓣。

2. 注射结束，整株转移至暗处复苏。

注意：注射前期及暗处理阶段，请勿浇水，待暗处理结束后，可依花苗状态适量浇水。

3. 次日取出花苗，正常光照培养。

四、自发光强度观察

注射后36小时即可观察花瓣发光情况。

三、注意事项

1、测定菌种活力，侵染液须在指定浓度范围下。

2、侵染材料需避光处理，浇水适量，避免影响侵染效率。

3、注射花瓣操作尽量轻柔，以免造成二次伤害，影响观感。

王晓娟，深圳华大生命科学研究院-数字化地球研究所，主要从事植物基因组编写技术开发及应用示范，以农杆菌介导的植物瞬时转化技术为工具将真菌自发光通路整合到植物细胞内发挥功能；

陈立川，深圳华大生命科学研究院-数字化地球研究所，主要从事植物细胞多组学研究，通过生物信息学等技术挖掘真菌自发光代谢通路及其调控基因，并设计表达模块使其在植物细胞内发挥功能。

五、致谢

感谢深圳华大生命科学研究院提供实验平台。感谢项目负责人夏科科老师，以及研究院各部门老师提供的技术支持。

Bio-protocol 简介

Bio-protocol于2011年在斯坦福大学创建, 致力于搭建全球权威的、高质量的生物实验方案分享平台，以助力科学发现。

Bio-protocol期刊是Bio-protocol旗下的一份同行评审的国际学术期刊，发表高质量的生命科学实验方案，旨在提高科研的可重复性。至今，

Science、

eLife等12家国际权威科学杂志建立长期合作关系，共同促进生命科学研究的可重复性。2019年

Bio-protocol期刊已被PubMed Central，ESCI收录。

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