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番茄TM6是花发育的转录调控因子

来源：花匠小妙招时间：2025-10-16 02:01

题目：Insights into the functional role of tomato TM6 as transcriptional regulator of flower development

刊名：Horticulture Research

作者：Juan Capel, Rafael Lozano et al.

单位：Universidad de Almería, Spain

日期：16 January 2024

摘要

花的发育是完成植物生命周期的关键一步。花形成的生理过程和基因调控机制已被广泛表征，MADS-box转录因子作为花形态的主要调控因子的含义已被广泛描述，主要是由于对模式种中功能缺失突变体的分析。

然而，来自作物物种的几个MADS-box同源基因的等位基因变异的详细特征尚未描述。

在这里，我们已经鉴定了一种具有异常花朵发育的番茄突变体。突变植物表现出花瓣细胞特性的变化，以及雄蕊向心皮状结构的同源性转化，在大多数情况下，这会产生肉质器官。

分子分析证明，番茄MADS-BOX 6（TM6）基因的功能缺失突变是这种突变表型的原因。此外，由于TM6功能的丧失，已经检测到参与生殖发育的其他MADS-box基因的转录和mRNA处理的失调。

我们的研究结果表明，TM6是控制花发育的MADS-box基因复杂调控网络中的关键参与者，也提供了一种新的突变体，可能有助于在番茄中产生雄性不育系。

技术路线

The sus2 mutant was identified as part of the screening of a chemically mutagenized population obtained in the tomato cultivar Moneymaker (MM) using EMS

Genetic mapping of the sus2 mutation

RNA isolation and whole transcriptome sequencing

Pollen viability assays

Scanning Electron Microscopy

Quantitative real time PCR expression analysis

Alternative splicing analysis

主要结果

3.1 sus2突变损害生殖发育

作为在S.lycopersicum cv.MM中获得的EMS突变体集合的筛选的一部分，我们鉴定了一个M2家族，其中单个植物没有表现出营养发育或开花时间的改变（图1a）。然而，一些成员的生殖结构出现严重异常。在开花期，这些突变植物的萼片是正常的，但它们的花瓣比野生型植物的花瓣小，并且它们的雄蕊保持绿色，并且看起来卷曲和未融合（图1b）。

此外，花粉活力测定证明，突变雄蕊不能产生花粉，从而产生雄性不育花（图1c）。这些突变植物产生较小的单性结实果实，可能是由于缺乏活花粉（图1d）。突变的遗传分析在较大的M3分离群体中进行，在267株植物中的64株中观察到突变表型。

图1。sus2突变表型。a 与野生型（WT）植物相比，sus2突变体植物在营养生长方面没有表现出差异。b sus2花看起来更小，雄蕊表现出异常的形态。c用氯化四氮唑进行的花粉活力测定证明，野生型植物产生大量有活力的染色花粉，而在sus2突变体花中没有观察到花粉粒。d突变果实较小，单性结实（无籽）。

在发育后期，突变体花的一些雄蕊转化为多肉器官，这就给突变体命名为多肉雄蕊2（sus2）。这些转化的肉质雄蕊在生长和成熟过程中保留在果实中（图2a和2b），在纵向截面上观察时显示出与心皮相似的结构（图2c）。为了表征sus2突变体表型的这一方面，分析了总共124株M3突变体植物，目的是确定这些植物产生的前10个果实中发育的多肉雄蕊的数量。在所有这些突变植物中都观察到肉质雄蕊，尽管每株植物的果实数量不同。在这些果实中，54.11%的果实不发育肉质雄蕊，33.23%的果实发育在1-3个肉质雄蕊之间，12.66%的果实发育4-6个肉质雄蕊（图2d）。总之，这些数据表明，sus2突变体植物表现出的多肉雄蕊的性状发育具有完全外显性但表现力可变。

图2:sus2突变体果实发育出肉质雄蕊。a所有sus2突变体植物都发育出不同数量的多肉雄蕊，在果实生长和成熟过程中融合到心皮上，在同一果实中可以观察到突变体和正常果实。b野生型（WT）和突变体果实的俯视图，其中所有雄蕊看起来都附着为肉质器官。c突变体果实的纵向切割显示肉质雄蕊和心皮形态之间的相似性。d多肉雄蕊在突变果实中出现的数量可变，从零到所有转化为多肉结构的雄蕊。

3.2 sus2花表现出花瓣原基和雄蕊原基的同一性变化

为了阐明在sus2突变体植物中观察到的形态变化，我们对WT和sus2植物的四轮开花花的表皮细胞特性进行了SEM分析（图3）。我们研究了这些器官的三个部分的细胞特性，即基底、中间和远端部分。在sus2植物的萼片和心皮中没有观察到细胞的变化，因为在这些器官中形成的表皮细胞与在WT花中观察到的相同（图3）。然而，与野生型植物的表皮细胞相比，sus2花瓣的表皮细胞表现出细胞特性的变化，反映在大小和形状的差异上（图3）。sus2花瓣的表皮细胞的与野生型植物中的细胞的身份不相似。

在sus2雄蕊的表皮细胞中观察到的形态。在远端部分，sus2雄蕊（图3s）表现出与WT柱头相似的柱头形态（图3j）。突变体雄蕊的中段细胞被拉长（图3t），与野生型的细胞相似（图3k），而不是野生型雄蕊中常见的圆形表皮细胞（图3h）。最后，突变雄蕊基部的细胞（图3u）与野生型相比更小且不规则（图3i），与野生型卵巢的细胞相似（图3l）。总之，在sus2花的花瓣和雄蕊中观察到的同源异型性变化表明，sus2可以被认为是B类突变体。

图3。野生型（WT）和sus2突变体植物开花花的远端、中间和基部的扫描电子显微镜分析。

WT萼片（a-c）、花瓣（d-f）、雄蕊（g-i）和心皮（j-l）的表皮细胞形态。sus2突变体萼片（m-o）、花瓣（p-r）、雄蕊（s-u）和心皮（v-x）的表皮细胞形态。

3.3 SUS2基因的克隆及其分子特性研究

为了鉴定sus2突变的基因，进行了定位策略。从sus2突变体植物与来自野生LA1589的植物的杂交产生F2分离群体。对129株F2分离植物形成的群体进行表型评价。其中，检测到27株sus2突变体，证实了单基因隐性遗传。通过用沿基因组分布的共显性标记对所有F2植物进行基因分型来进行作图。这种策略使我们能够识别600Kb的基因组区域作为携带位于2号染色体上的突变的候选者（图4a）。精细定位是通过全基因组测序方法完成的。我们对分别来自25个WT和19个突变体F2植物的等摩尔量DNA形成的WT和突变体库进行了测序。等位基因频率的分析证实了sus2突变在2号染色体上的位置。之后，对包含候选区域的区间进行变异分析，使我们能够识别出一种独特的突变，即Solyc02g084630基因**外显子中的单碱基缺失（图4b）。

在sus2中检测到的突变导致TM6中的移码，因此突变蛋白缺乏所有功能结构域，包括MADS结构域（图4c）。为了支持通过测序映射鉴定的突变与sus2突变表型之间的因果关系，通过使用CAPS共显性标记进行共分离分析，该标记旨在检测TM6基因组序列中鉴定的缺失。在M2和F2分离群体中进行共分离试验（图4d），这表明所有91个sus2突变体植物都是单一胸腺嘧啶缺失的纯合子，而207和98个表型WT植物分别是半合子或缺乏缺失，表明sus2表型与Solyc02g084630基因的单碱基缺失共分离。这些结果，再加上在2号染色体候选区域中没有额外的突变，以及sus2是B类同源异型突变体的事实，使我们得出结论，TM6（拟南芥B类基因AP3的旁系同源物）中已鉴定的突变是sus2突变体表型的原因。

图4。SUS2结构a 使用共显性标记的F2分离群体的定位鉴定了在2号染色体上携带sus2突变的候选区域。括号中的数字表示在基因和所分析的每个遗传标记之间鉴定的重组染色体的数量。注意，在47.7Mb标记位置没有发现重组体（红色字母）。b 通过测序作图法对该区间进行精细作图，变异分析在Solyc02g084630基因的**个外显子中发现了一个单碱基缺失，先前命名为TM6。c 由于sus2突变，TM6突变蛋白缺乏所有功能结构域，包括大部分MADS-box结构域。d 在针对sus2突变的M2分离群体的20株植物中进行的共分离试验。

3.4 sus2花的转录组学变化

为了确定TM6在控制花发育的遗传网络中功能丧失引起的转录组学变化，在WT和sus2突变体植物的花蕾中进行了RNA-seq分析。所分析的发育阶段包括花器官原基形成期间的花，即FB0（花蕾0）、FB1（花蕾1）和FB2（花蕾2），以及花前阶段（PA）的花、花日阶段（AD）的花和花后两天的花（AD2），因为已经描述TM6转录物在成熟的花器官中更丰富。分析了每个基因型和发育阶段总共三个生物重复。所获得的结果显示，在所有花发育阶段，WT和sus2突变体植物之间共有2895个差异表达基因（DEG），其中343个DEG上调，2552个下调（图5a和b）。

通过GO和KEGG途径富集分析检测到的DEG的功能相关性。在下调的DEG中，最显著的GO包括与花粉发育、花粉管生长、花粉外壁形成和花药壁绒毡层形成有关的GO，而与细胞核和植物激素合成有关的GO术语，如赤霉素、水杨酸和茉莉酸，被发现用于显著上调的DEG（图5c）。

关于KEGG富集分析，上调的DEG富集在与氨基酸和次级代谢产物生物合成以及植物激素信号转导相关的途径中，而下调的DEG则富集在糖相互转化途径中。对DEG的详细分析显示，尽管在sus2花中同样检测到TM6转录物，但TM6基因在所有发育阶段都显著下调（图5d）。此外，还发现与花发育相关的其他14个MADS-box基因的表达水平发生了显著变化，这些基因也被发现下调（图5d）。根据基因表达丰度区分了四个聚类。簇1和簇2包括在整个花发育过程中在WT和突变体植物中强烈表达的基因，而簇3和簇4包括在这些花组织中表达水平较低的基因（图5d）。TM6旁系SL/TAP3在AD2花后期被发现显著下调。

关于其余的B类功能基因，尽管在四个花发育阶段TPI的下调是显著的，但没有观察到TPIB的表达水平的改变。至于其余差异表达的MADS-box基因，观察到C类基因TOMATO AGAMOUS 1（TAG1）和ARLEQUIN/TAG-LIKE 1（ALQ/TAGL1）的不同表达动力学。TAG1的下调在FB2和PA阶段是明显的（图5d），而ALQ/TAGL1的转录水平没有观察到显著变化。此外，我们发现JOINTLESS，一种对果实脱落区发育至关重要的MADS-box基因，在从FB2到AD2的sus2突变体花中显著下调。

在这些相同的阶段，SlMADS84基因表现出差异表达（图5d）。另外9个MADS-box基因也被发现在sus2花中差异表达，如TAGL12。考虑到sus2发育出心皮状雄蕊而不产生花粉，我们详细检查了花粉发育相关基因的转录活性。发现有110个基因在至少一个分析的花发育阶段中差异表达。这些基因中有94%在sus2突变体中被发现有差异地下调。

图5。sus2突变体花的转录组学变化。

a在所有分析的花发育阶段共检测到2895个差异表达基因。

b这些DEG中的大多数在sus2突变体花中被发现下调。

c显著丰富了下调和上调DEG的GO分析。

d野生型（WT）和sus2突变体花中差异表达的MADS-box基因的层次聚类。

FB0，花蕾0；FB1，花蕾1；FB2，花蕾2；PA，花在花前阶段；AD，花在花期；和AD2，花在开花后两天

基于WT和突变体植物中花粉发育相关基因的表达谱，鉴定了多达8个聚类。值得注意的是，簇1中的基因从FB1到AD2被强烈下调。其中，与雄配子体发育相关的基因，如参与花粉萌发的晚花番茄52（LAT52），明显下调。簇4和簇6中的基因在花发育的后期（从PA到AD2）被发现差异表达，而簇5、簇7和簇8包括在从FB0到FB2的sus2中被差异抑制的基因，这表明这些基因在花粉发育的早期阶段起着关键作用。在簇5中定位了雄性不育1035（MS1035）基因，其功能丧失与花药发育过程中减数分裂缺陷和绒毡层畸形有关。在簇8中，发现了SlAMS，这是拟南芥脱落小孢子（AMS）的番茄同源物，参与了绒毡层的早期发育及其在花发育后期的降解。

最后，番茄中介子单元18（SlMED18）基因的表达没有变化，其功能缺失突变体显示出类似于sus2的果实表型和雄蕊到心皮的同源异型转化，尽管其果实的不完全外显率低于10%。此外，TM6功能的丧失显著增加了心皮特异性基因的表达。SlTTS基因就是这种情况，它是来自烟草传递组织特异性基因的一种雌蕊特异性基因同源物，在所分析的所有发育阶段，它在sus2花中都被上调。

值得注意的是，番茄CRABS CLAW b（SlCRCb）旁系在FB1、PA和AD阶段的上调，该基因在心皮形成和分生组织决定中起着关键作用。为了确认RNA-seq检测到的表达水平，进行了比较实时PCR（RT-PCR）分析。通过Spearman试验证明了两种检测方法之间的相关性，该试验对RNA-seq TPM值和∆CT值进行。关于B类基因，该分析证实了sus2中TM6的下调，表明该基因在花发育的不同阶段调节其自身的表达，以及其他MADS-box基因。

另一方面，TM6旁系SL/TAP3的表达水平在FB0、FB1和PA阶段检测到轻微变化，而AD2的差异更为显著，这与RNA-seq分析的结果一致。类似地，在所评估的六个花发育阶段中的五个阶段，发现在sus2中TPI基因的表达水平下调。我们还分析了C类TAG1基因的表达，发现其在从FB1到PA的sus2和AD2中下调。此外，发现在从FB1到AD2的sus2中，JOINTLESS MADS-box基因表达下调，如先前在RNA-seq分析中观察到的。此外，还研究了与花粉和柱头发育相关的基因的表达水平。因此，雄性配子体特异性MS1035、SlAMS和LAT52基因的下调在整个发育阶段都是明显的。相反，柱头特异性SlTTS基因从FB0到AD阶段被高度诱导，与RNA-seq分析中观察到的一致。

3.5 sus2突变改变了转录本

为了进一步评估TM6不仅在转录控制中的作用，而且在基因表达调控的其他方面的作用，我们对花蕾不同发育阶段表达的基因进行了研究，重点是局部剪接变异（LSV）分析。使用边际百分比选择指数（PSI）在野生型和sus2突变体样本中比较mRNA变体读数，这使我们能够说明映射到每个基因并支持每个剪接事件的读数的比率。在所分析的每个花发育阶段，两种基因型检测到的剪接变体如补充表S6所示，其中包括基因名称、染色体位置和功能描述，以及典型剪接位点的差异使用（SS与LSV）和替代剪接事件信息，即：5’供体或3’受体剪接位点（A5SS/A3SS），外显子跳跃（ES）或内含子保留（IR）。

补充表S6中还显示了每个检测到的同种型的德尔塔PSI值，以及通过RNAseq分析评估的基因转录状态。利用该分析共检测到1278个基因的2384个选择性剪接异构体，其中595个具有供体A5SS位点（24.95%），665个具有受体A3SS位点（27.89%），783个显示IR（32.84%），341个显示ES（14.30%）。特别值得注意的是，与花发育相关的MADS-box基因在两种基因型之间发现了剪接位点的差异使用。这就是TAGL12（Solyc11g032100）和ALQ/TAGL1（Solyc07g055920）基因的情况，TAGL12已被发现主要在花中表达，ALQ/TAGL11在花发育过程中普遍表达。在AD的花期，TAGL12基因经历位于第三内含子的选择性转录起始。值得注意的是，所有检测到的替代亚型在野生型花中比在sus2花中更频繁地发现（图6a，b）。此外，还从FB0到PA花期检测到ALQ/TAGL1（Solyc07g055920）基因的替代异构体（图6c）。有趣的是，该基因检测到的所有广泛的异构体在**外显子和第二外显子之间都存在四个替代供体5'和四个受体3'剪接位点。

图6。由TAGL12和ALQ/TAGL1基因中的sus2突变引起的mRNA处理改变。

a TAGL12基因的基因组组织。5'和3'UTR区域被描绘成灰色方框，基因模型的编码外显子被描绘成黑色方框。方框之间的线代表内含子，

b在转录组分析中检测到的所有转录物都用所用供体和受体位点的位置表示。

c ALQ/TAGL1基因的基因组组织。

d ALQ/TAGL1基因的**内含子的选择性加工。显示了在FB2阶段在WT和sus2花中检测到的每个转录物的量。

结论

在这项工作中，我们对一种番茄雄性不育突变体进行了鉴定，该突变体被鉴定为甲磺酸乙酯（EMS）突变体集合的一部分，显示出花朵形态发生的明显变化。我们将这种突变体命名为多肉雄蕊2（sus2），因为sus2突变体植物中的大多数雄蕊表现出心皮样的特性，并作为多肉结构保留在成熟果实中。

精细定位分析显示TM6基因对这种表型负责。TM6基因属于拟南芥B类基因AP3的旁系谱系，其起源于AP3谱系中的重复事件。TM6基因先前被认为仅与雄蕊发育有关。

我们的发现不仅确定了TM6基因的一个新等位基因，而且揭示了其作为一个真正的B类基因的功能分类，该基因涉及番茄雄蕊和花瓣的形态发生以及果实发育。

原文获取

原文链接：

https://academic.oup.com/hr/advance-article/doi/10.1093/hr/uhae019/7560473?searchresult=1

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https://www.scientsgene.com/h-nd-294.html

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