火龙果中的糖分太高？那是你没用Dof转录因子技术调控

火龙果是当前国内快速发展的一种新兴水果，果实外形奇特，颜色鲜艳，并且营养物质丰富，具有较高经济价值，可溶性糖的组成和含量是影响果实风味品质的重要因子之一，火龙果果实主要以积累单糖为主，果实不同部位的可溶性糖含量也存在差异，但目前对火龙果果实糖代谢及转运相关的调控机制研究较少。

Dof转录因子是植物特有的一类转录因子，参与调控植物生长发育和次生物质代谢等多种生物学过程，然而Dof转录因子是否参与果实糖代谢及转运，及其具体的调控机制，目前很不清楚。

为此本实验以‘莞华红’红肉火龙果为研究对象，分析果实发育过程4个不同部位（果实中心部位、顶部、基部和边缘）的蔗糖、葡萄糖和果糖含量的动态变化，糖代谢及转运蛋白相关基因的表达变化，从转录组数据中筛选出3个Dof转录因子，研究它们的亚细胞定位、转录活性及其对糖代谢及转运蛋白相关基因的转录调控效应，从而揭示Dof转录因子调控火龙果果实糖代谢及转运的分子机制。

Dof转录因子的结构特征

Dof属于锌指蛋白中的一类亚家族转录因子，通常含有200-400个氨基酸，其主要结构由N末端的DNA结构域和C末端的转录调控区组成。在N端的DNA结合区由52氨基酸组成，其中包含4个高度保守的半胱氨酸（Cysteine,Cys）残基和1个Zn2+离子，它们通过共价结合而形成Cys2/Cys2的锌指结构。

Zn2+离子的存在和Cys残基的保守都是Dof蛋白保持活性所必需的，任何的缺失或替换都可能会导致Dof蛋白活性的丧失。

位于C端的转录调控域序列变化较多，与调控蛋白与蛋白和蛋白与DNA相互作用等方面发挥着重要作用，也因此奠定了Dof蛋白在植物中功能多样性的基础，此外Dof转录因子可通过特异识别下游靶基因启动子中的AAAG/CTTT元件（南瓜中为AAGT/ACTT序列）而调控下游基因的表达。

已有的研究表明，Dof转录因子因其功能的多样化而在在植物的生理生化反应中发挥着关键的调控作用，主要包括种子发育，组织分化和代谢调控等。拟南芥中的Dof基因DAG1被报道能通过抑制赤霉素合成基因GA3ox1基因表达而减少赤霉素含量，从而抑制种子萌发，表明DAG1在种子萌发过程中时一个负调控因子。

AtDof6能与TCP14蛋白相互作用，共同促进种子萌发。总的来说，关于Dof转录因子的生物学研究还是多集中于拟南芥和水稻等模式植物，以及种子萌发，光周期诱导，代谢调控等生物学过程，对果实中的Dof基因的关注较少，对Dof转录因子调控果实品质形成的研究更为少见，对Dof转录因子调控果实糖代谢和转运机制的研究还未见报道。

火龙果果实因其果实外形奇特，颜色鲜艳，口感清甜，且营养物质丰富等特点而广泛受到消费者的喜爱。可溶性糖含量是果实风味品质的重要组成部分，目前关于可溶性糖的研究多集中于对果实生长发育阶段，糖组成成分及含量变化等的生理生化指标测定，以及关键酶基金的荧光表达水平验证，而对该生物学进程所受到的调控机制缺乏系统了解。

已有的研究表明，Dof转录因子在参与种子发育，组织分化和代谢调控等植物生长发育过程中发挥着重要的调控作用，而Dof转录因子对调控果实品质形成的研究较为少见。

因此以糖代谢和转运酶为切入点，重点围绕Dof转录因子，对火龙果发育成熟过程中Dof调控的糖代谢和转运机制开展研究，对进一步阐明果实糖分积累机制，提高果实耐贮性及改良果实品质具有重要的生物学意义。

Dof转录因子调控火龙果果实糖代谢及转运

火龙果果实中可溶性糖分的积累主要包括以蔗糖，葡萄糖以及果糖因此本实验对火龙果果肉不同生长阶段不同部位的葡萄糖，果糖，蔗糖进行检测。分别将单个火龙果果实果肉分别标记为部位A（果肉中心部位）、B（边缘部位）、C（果实顶部）、D（果实基部）。

采用高效液相色谱仪对每个部位的蔗糖，葡萄糖和果糖进行测定，从测定结果来看，火龙果果实果肉糖含量以葡萄糖最多，果糖次之，蔗糖相对最少。

在果实果肉颜色由白转红的过程中，果肉葡萄糖及果糖含量迅速上升，其中葡萄糖含量上升最快，在32DAAP，果肉颜色完全转红时，葡萄糖和果糖含量达到最大值。在果肉不同部位也存在差异，其中果实中心部位糖含量最高，果实基部糖含量相对于其他部位较少。

根据课题组前期获得的转录组数据，筛选到3个与果肉可溶性糖含量变化密切相关的Dof转录因子，分别为HpDof1.7，HpDof5.3，HpDof5.4。进一步通过qRT-PCR实验，对火龙果HpDof1.7/5.3/5.4基因的荧光表达水平进行了研究。

图中荧光结果表明HpDof1.7/5.3/5.4基因在火龙果果实不同生长发育时期及不同部位中的表达均呈上升趋势。HpDof1.7/5.3/5.4荧光表达水平变化趋势与火龙果外观变化与可溶性糖含量变化趋势相似，在果实生长过程中表达量升高，且在不同部位中的表达也存在差异。

为研究HpDof1.7/5.3/5.4转录因子的进化关系，通过MEGAX软件将火龙果的HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4的氨基酸序列与从基因组数据库中获得的拟南芥（Yanagisawaetal.,2002）和番茄（Caietal.,2013）中的其它Dof转录因子氨基酸序列进行了进化关系分析。

植物转录因子在植物细胞核中参与转录调控植物相关基因表达的作用，因此大部分转录因子定位于细胞核中，运用Cell-PLoc在线分析软件预测到HpDof1.7/5.3/5.4都定位于植物细胞核中，均为核蛋白。

为进一步验证，我们将目的基因插入到含有EGFP蛋白的pBin19-EGFP载体中，让目的蛋白与EGFP蛋白形成融合蛋白，用电击转化的方法，将目的质粒转入农杆菌中，通过瞬时表达的方法侵染烟草叶片细胞。

EGFP蛋白在激发光的作用下发出绿色荧光，在正置荧光显微镜中可观察到，没有连接目的基因的EGFP在细胞核及细胞壁中均发光，而连接了目的片段的绿色荧光蛋白只在细胞核中发光，结果表明HpDof1.7/5.3/5.4都定位于细胞核中，为核蛋白。

关于Dof转录因子调控的火龙果果实糖代谢与转运的讨论

Dof转录因子是植物所特有的一类转录因子，参与调控植物生长发育和次生物质代谢等多种生物学过程，包括种子发育，组织分化、代谢调控和逆境响应等，然而Dof转录因子调控的果实发育成熟进程鲜有报道。

甘薯中的Dof基因SRF1能够通过对液泡转化酶基因的负调控而调节贮藏根中的糖类代谢，甘薯内的超表达SRF1基因可以降低酸性转化酶的活性，使淀粉含量增强，以及葡萄糖和果糖含量降低。

从火龙果果肉DNA中分离到了含有Dof结合元件AAAG/CTTT的糖转运相关基因HpSWEET14和HpTMT2的启动子，并在课题组前期获得的糖代谢相关基因HpINV2和HpSuSy1的启动子中也找到了Dof结合元件，进一步通过EMSA和双荧光素酶报告基因实验（DLR）发现HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4能够能直接结合HpINV2、HpSuSy1、HpSWEET14和HpTMT2基因的启动子，并激活它们的转录。

以上研究结果首次在火龙果果实中解析了Dof转录因子通过直接激活糖代谢和糖转运相关基因的表达来调控糖代谢和转运进程，从而影响火龙果果实生长和发育过程中的糖分积累，后续研究可继续寻找HpDofs是否存在蛋白互作以及形成复合体后对糖相关下游基因的调控效果，并通过转基因果实实现核心HpDofs在调控糖代谢和转运过程中的生物学功能验证。

目前本研究所取得的研究进展明确了Dof转录因子可以直接激活糖代谢和糖转运相关基因的表达，调控糖代谢和转运，从而影响火龙果果实的糖分积累的分子机制。论文研究结果可为火龙果的遗传改良，培育质优火龙果新品种提供重要基因资源。

结论

论文以火龙果果果实生长发育过程中关键的糖代谢和转运酶基因为切入点，重点围绕Dof转录因子，对火龙果果实发育过程中Dof调控的糖代谢和转运机制开展研究，其中液相色谱测定火龙果果实不同发育阶段及不同部位的可溶性糖含量，实验结果表明，火龙果果实主要以积累葡萄糖和果糖为主，蔗糖含量较少。

果实中心部位的葡萄糖和果糖含量高于其他部位，且果实不同部位的葡萄糖和果糖含量在果实转色后逐渐上升。荧光定量PCR分析结果显示，果实发育过程中，随着糖含量的提高，糖代谢相关基因（HpINV2和HpSuSy1）和糖转运相关基因（HpSWEET14和HpTMT2）的表达量也逐渐升高。

从火龙果果实发育过程相关的RNA-seq表达谱中挑选出3个Dof转录因子HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4，并克隆了它们的基因全长序列。氨基酸序列比对和进化树分析表明，它们都含有典型的Dof转录因子的保守域且分布在不同亚族。

亚细胞定位实验显示HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4均定位在细胞核，是核蛋白。酵母和烟草体内的转录激活实验表明HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4都具有转录激活活性。克隆获得了HpSWEET14和HpTMT2基因的启动子序列。

凝胶阻滞分析和双荧光素酶报告基因实验结果显示，HpDof1.7、HpDof5.3和HpDof5.4能绑定HpINV2、HpSuSy1、HpSWEET14和HpTMT2的启动子，并激活它们的转录活性。

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